Врастание костной ткани в кальциофосфатную биокерамику с различными размерами пор

Общая площадь соприкосновения кальций-фосфатной (КФ) биокерамики с окружающими тканями зависит от степени пористости ее поверхности. Этот показатель, как оказалось, определяет не только скорость проникновения биологических жидкостей и биодеградацию материала, но является важным элементом, определяющим процессы заселения имплантата костными клетками. Так, площадь рабочей поверхности плотного и пористого гидроксиапатита (ГА) может достигать 0,01 и 1,0 м²/г, соответственно (Tofe et al., 1993).

При диаметре пор 20-200 мкм в макропористых материалах возникает естественная конвекция жидкости за счет капиллярных процессов. Это способствует транспортировке веществ, биодеградации или растворению материала (Аксельруд, Молчанов, 1977). Так, при использовании кораллов со сквозной пористостью процесс клеточной миграции и остеокласт-ной резорбции материала протекает в течение 6-8 недель. Если поры между собой не соединяются, то появляются замкнутые полости, из которых затруднен выход веществ. При этом процесс биодеградации может затянуться до 18 месяцев (Щепеткин, 1995; Pollick et al., 1995).

При исследовании способности врастания кости и характеристик биодеградации использовались два вида пористой кальций-фосфатной керамики, с четырьмя различными диапазонами размеров пор (45-80 мкм, 80-140 мкм, 140-200 мкм и 200-250 мкм). Все биоматериалы имели однородное распределение пор и пористость 45%. Полученные данные позволили Mainard et al. (1996) предположить, что для врастания кости как в ГА, так и в β-трикальциофосфатную керамику, необходим размер пор более 80 мкм. Количество кости в ТКФ керамике было выше, чем в ГА-имплантатах. Разницы между тремя самыми большими размерами пор (80-140, 140-200 и 200-250 мкм) не отмечено. Доля резорбции в случае ТКФ через 12 месяцев составила 50%, а для ГА - только 5%. Причем процесс биодеградации был статистически значим только с 4-го месяца эксперимента. По-видимому, биодеградация имплантатов уменьшает влияние размера пор на врастание кости, так как через шесть месяцев в случае ТКФ не отмечалось различия между всеми размерами пор (Minardi et al., 1996). Следует подчеркнуть, что ранние остеоиндуктивные свойства связаны с видом используемых животных, очевидно из-за того, что они обладают различным метаболическим статусом организма и особенностями кроветворной системы. У собак внутримышечный остеогенез наблюдался примерно через 25-45 суток, когда на имплантате были обнаружены преостеобластические элементы, которые к 60-му дню трансформировались в костные клетки. При этом во время всего остеогенеза образование хрящевой ткани не наблюдалось (Chen et al., 1996).

Проведенные нами исследования пористых и текстурированных титановых сплавов показали, что они не проявляли ОК и ОИ свойства на модели эктопического костеобразования, т.е. сами по себе поры или макрорельеф без КФ не несут в себе морфообразующую функцию для костной ткани: при введении пористых материалов в кость остеогеная и стромальная ткань как бы вдавливается внутрь материала за счет увеличения клеточной массы. Следовательно, размер ячеек, очевидно, не может влиять на экспрессию остеобластного фенотипа через, например, процессы трансдукции, происходящие с участием цитоскелета. По крайней мере, при использовании биоактивных стекол (45S5) с различным размером пор (тестировали три образца с диаметром пор менее 75, 75-210 и более 210 мкм и пористостью около 44%) сама по себе адгезия клеток линии ROS 17/2.8 не приводит к экспрессии специфического остеобластного фенотипа. Уровень продукции апатитного слоя, коллагена и узелков, активность щелочной фосфатазы в клетках не зависела от размера пор (Effah et al., 1998). Однако авторами не были использованы специфические молекулы и другие лиганды, которые по силе своего действия на геном клетки могут превосходить простые адгезивные механизмы. Тем не менее, можно сделать вывод о том, что вклад молекул адгезии в создании специфического костного микроокружения, очевидно, менее значим, чем специфических ростовых факторов. Остеоиндукция материала проявляется только после образования на поверхности материала апатитного слоя. Иными словами, без изначального существования или формирования минерального КФ матрикса, в частности под действием биологических жидкостей или метаболитов, костная ткань не образуется на вводимом в организм материале (Li, 1994).

Одной из особенностей кальциофосфатной керамики является то, что она обладает тропностью к специфическим ростовым факторам и макромолекулам, обеспечивающим костное микроокружение, необходимое для обеспечения процессов пролиферации и дифференцировки остеогенных прекурсоров. Очевидно, что мы имеем дело с пока еще мало изученным, по-видимому, выработанным в процессе эволюции механизмом, с помощью которого осуществляется контроль за ростом и развитием костной ткани.

Теоретически, концентрация ростовых факторов в замкнутых порах может возрастать в десятки раз, создавая тем самым благоприятные условия для роста костных клеток-предшественников.

Опыты были проведены на 80 самцах мышей линии СВА массой 18-21 г. Часть мышей забивали эфиром, после чего из бедренной кости извлекался столбик костного мозга (15х10⁶ клеток/мл), переносился в среде DI-MEM (ISN), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭТС), на диски, выполненные из натуральных КФ (диаметр 12 мм, толщина 1,2 мм, пористость 45%, величина пор <70, 70-100, 100-200, 200-400 мкм), и оставлялся на 30 мин при 37 °С. В ряде опытов использовали среду без ЭТС. Натуральные КФ были получены из костной ткани крупного рогатого скота путем обжига в муфельной печи, измельчения, многократной промывки, сушки, просеивания порошка через сита с определенным диаметром, прессованием и обжигом при 1250 °С в лаборатории кафедры силикатов Томского политехнического университета. Химический состав КФ и кристаллическая структура исследовались с помощью рентгеноструктурного анализа, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии. Затем проводилось качественное определение величины адгезии (способность к прикреплению костного мозга к дискам) после 10-кратного покачивания дисков в течение 2-5 мин в среде D-MEM при 37 °С, с оценкой результатов в условных единицах (+ слабая адгезия, костный мозг отделяется при 3 покачиваниях; ++ умеренная адгезия, костный мозг отделяется от подложки при 8 покачиваниях; +++ сильная адгезия, ткань не отделяется от субстрата; - отсутствие адгезии).

Часть дисков имплантировали без костного мозга для изучения остеоиндуктивных свойств. Одному животному вводили под кожу 4-6 дисков. Через 30 суток животных забивали эфиром, диски вынимали, под оптическим микроскопом определяли площадь распространения костной ткани (остеокондуктивные свойства) и выраженность образовавшейся (индуцированной) костной ткани в баллах (- отсутствие реакции, + слабо, ++ умеренно и +++ сильно выраженные остеоиндуктивные свойства), с последующим проведением гистологических исследований. Кроме того, оценивали реакцию окружающих тканей на воспаление с проведением цитологических реакций с мазков отпечатков окружающих тканей или образование фиброзной капсулы. Часть материала фиксировали в 0,125% растворе глютарового альдегида и после обезвоживания препаратов и напыления золотом подвергали сканирующей электронной микроскопии. Остеоиндуктивные свойства определяли морфометрическим методом по площади разрастания костной ткани на ГА.

Отношение кальция и фосфора в используемых КФ составило 1,34, доли аморфного и кристаллического КФ равнялись 80 и 20% соответственно, пористость - 45-55%. Установлено, что ОК и ОИ свойства и реакция соединительной ткани КФ керамики зависят от величины пор. Однако эта зависимость не носит линейного характера. Так, у образцов с диаметром пор менее 80 мкм образования или продвижения костной ткани из костномозгового эксплантата выявлено не было. Затем, в диапазоне от 80 до 300 мкм наблюдается линейная зависимость роста костной ткани на КФ дисках. Образовавшаяся костная ткань имела незрелую губчатую структуру, границы контакта с КФ могли быть нечеткими (для крупнопористой керамики диаметр пор более 100 мкм) или в виде ограничительной линии (для мелкопористой керамики, диаметр пор менее 100 мкм). Затем, у образцов с диаметром пор 300-400 мкм остеокондуктивные свойства снижались, по-видимому, вследствие появления стромальной капсулы, а остеоиндуктивные свойства продолжали возрастать (Карлов и др., 1999, 2000; Shakhov et al., 2000).

Микрофотография препарата кальциофосфатной керамики на 40 сутки после имплантации костного мозга (кроме опыта 6). 1 - диаметр пор менее 10 мкм, костная ткань не обнаруживается; 2- (80-150 мкм) наблюдаются слабые; 3 - (150-200 мкм) средние; 4 - (200-300 мкм) максимальные ОК свойства; 5 - при диаметре пор более 350 мкм стромальная ткань угнетает остеогенез; 6 - остеоиндукция на КФ дисках с диаметром пор 200-300 мкм. Нативный препарат, ув. х20

При использовании крупнопористых образцов с диаметром пор 400-600 мкм ОИ и ОК резко снижаются, вероятно, за счет того, что вокруг них образуется значительная стромальная капнула, ухудшающая, вероятно, кровоснабжение костных клеток. Следует отметить, что величина врастания костной ткани в ГА составила около 50-80 мкм, тогда как экспансия костной ткани по поверхности данного материала была равна 2000-5000 мкм. Очаги костеобразования формировались преимущественно внутри пор, заполняя их. Как правило, в эти ячейки проникали мелкие сосуды, идущие от окружающей соединительной ткани. В отдельных местах были видны остеокласты, формирующие лакуны на поверхности КФ.

Остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства натурального гидроксиапатита, выраженность воспалительной реакции и рост стромальной капсулы при имплантации под кожу мышам линии СВА на 1,2 месяца

Диаметр пор, мкм	Остеоиндуктивные, %	Остеокондуктивные, %	Стромальная капсула, %	Кровоснабжение, %
	0	0	0	0
80-120	20	40	0	15
120-200	35	800	18	35
200-300	100	100	22	100
300-600	15	10	100	14

С учетом вышесказанного теоретически цепь последовательности развития событий на КФ при имплантации его под кожу реципиентов представляется нам следующим образом. ГА обладает способностью к специфической адсорбции на своей поверхности ростовых факторов, цитокинов, гормонов, ДНК и ряда веществ и клеток, принимающих участие в остеогенезе. Можно полагать, что этот процесс имеет достаточно избирательный характер, идущий, в первую очередь, за счет хемосорбции остеогенных факторов. В результате этого процесса образуется сложный комплекс, который формирует специфическое костное микроокружение. При попадании на него циркулирующих остеогенных предшественников из окружающей костной ткани они начинают активно пролиферировать и дифференцироваться с образованием губчатой костной ткани. При этом поры, очевидно, в какой-то степени имитируют структуру и биологические свойства костных лакун, которые имеют схожий диаметр, составляющий около 80-300 мкм (Хэм, Кормак, 1973). Кроме того, под действием капиллярных сил в порах может создаваться необходимая концентрация КФ, кислорода, биоактивных веществ, необходимые рН, осмотическое, онкотическое давление, без которых нормальный остеогенез невозможен. В любом случае можно сделать однозначный вывод о том, что структурная организация поверхности КФ материалов несет важную позиционную информацию, создающую морфогенетическое поле для эктопического роста костной ткани во взрослом организме. Данный процесс, очевидно, протекает опосредованно, без первоначальной экспрессии генов.

Микрофотография препарата кальциофосфатной керамики на 20-е сутки после имплантации. В отдельных порах видно начало процесса остеоиндукции, связанного с образованием узелков костной ткани, к которым идут сосуды из окружающих тканей. Нативный препарат, ув. x100.

Зависимость массы (у.е.) и площади кости (мм²) от площади пористой поверхности (%) КФ диска

Зависимость площади и массы образовавшейся костной пластинки от площади пор КФ диска

Известно, что КФ обладает высокой способностью к связыванию различных молекул, включая белки, ферменты, фрагменты антител, нуклеиновые кислоты и др. (Berkeley et al., 1998). Так, при изучении роста остеогенных клеток на КФ поверхностях, обладающих различной кристалличностью и способностью к связыванию МБК-2, были выявлены следующие закономерности. Оказалось, что процесс связывания исследуемого ростового фактора предотвращает растворение КФ в тестируемых системах. Уровень связывания зависел от степени кристалличности кальциофосфатов. Так, высококристаллический КФ (кристалличность более 90%) адсорбировал около 90 нг/мл белка, а менее кристаллический (до 60%) - 60 нг/мл. Оптимальная концентрация МБК-2, обеспечивающая рост остеобластов костного мозга, составила 30-50 нг/мл. Установлено, что высококристаллические КФ обладают более высокой способностью к поддержанию роста остеобластных клеток по сравнению с более аморфной формой, а также контрольной пластиковой поверхностью в системе in vitro. Следовательно, остеоиндуктивные свойства кальциофосфатных материалов во многом зависят от их способности связывать на своей поверхности МБК-2 (Melican et al., 1998).

Стимуляцию процесса интеграции биоматериала с костной тканью можно осуществить не только через прямую активацию остеогенных клеток, но и путем ускорения неоангиогенеза, поддерживающего высокое напряжение кислорода в ткани. Так, в опытах на крысах было показано, что фактор роста фиброб-ластов-1 обладает способностью стимулировать процессы ангиогенеза и остеогенеза как самостоятельно, так и в сочетании с частицами КФ, сгустком фибрина и другими факторами, не вызывая развития фиброза или воспалительной реакции. При этом в зоне повреждения костной ткани уровень ФРФ-1 был достоверно выше, чем в противоположной неповрежденной кости (Kelpke et al., 1998).

Наши опыты по изучению остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств кальциофосфатной керамики в зависимости от степени кристалличности подтверждают, что рост костных клеток зависит от данного параметра. Известно, что кристаллизация КФ из аморфной фазы зависит от температуры обработки материала. При обжиге кальциофосфатных материалов при 600 °С степень кристалличности составляет около 60-70%, при 800-900 °С - 70-80%, а более 1250 °С - 90-95%. В связи с этим логично было предположить, что выраженность остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств КФ биоматериалов будет зависеть от степени кристалличности поверхности. Действительно, данные, представленные в таблице, подтверждают справедливость этого предположения (Карлов и др., 1999, 2000).

Зависимость между температурой обжига, степенью кристалличности и остеоиндуктивными, остеокондуктивными свойствами КФ материалов

Температурная обработка	Остеоиндуктивные свойства, в %	Остеокондуктивные свойства, в %	Степень кристалличности, %
600-700 ºС	0	12	60-70
800-900 °С	33	33	70-80
Более 1250 °С	100	100	90-95

Еще одним возможным механизмом, лежащим в основе остеокондукции, может быть так называемая «сортировка клеток, основанная на адгезии и миграции», протекающая с участием специфических лигандов и рецепторов (Fujii et al., 1998). При этом на поверхности биоматериала первоначально формируется слой, содержащий специфические молекулы адгезии. От их распределения зависят такие свойства, как способность к фиксации и перемещению по субстрату. Если клетки-мишени различаются между собой по этим свойствам, то они в зависимости от величины экспрессии на своей поверхности тех или иных рецепторов и количества родственных им лигандов будут подразделяться на соответствующие группы. В качестве молекул адгезии могут выступать разнообразные факторы, например фибронектин. Принципиальная возможность такого рода сортировки, по крайней мере в системе, была показана по отношению к Фн на клетках сублиний СНО, имеющих остеобластоподобные свойства. Оказалось, что миграционная способность этих клеток зависела от плотности лиганда. В зону повышенной концентрации мигрировало больше клеток, чем в менее насыщенную территорию. Предполагается, что, изменяя параметры процесса нанесения на материал того или иного адгезирующего фактора, можно влиять на процесс перемещения клеток по субстрату (Fujii et al., 1994). Мы использовали методы иммуноферментного анализа на установке «Мультискан» ЛКБ и технику клеточной адгезии в краткосрочной культуре ткани in vitro на дисках из КФ. В качестве препарата сравнения использовалась титановая поверхность, оксидированная анодно-искровым методом, или стекло. Установлено, что способность гидроксиапатита к сорбции БСА в 4 и 12 раз больше, чем у контрольных образов (стекло, оксидированный титан), соответственно. Во многом аналогичные данные были получены и по отношению к кроветворным клеткам. Если способность к адгезии костномозговых клеток по отношению к гидроксиапатиту принять за 100%, то кариоциты прикрепляются к стеклу на 80%, а оксидированному титану - на 15%. Следовательно, ГА, обладает более высокими адгезивными свойствами по сравнению со стеклом и титаном (Karlov, Shakhov, 2000).


А.В. Карпов, В.П. Шахов
Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики