Технологии изготовления каркасов для тканевой инженерии

После того, как была определена пригодность разлагаемого полимера для применения в костной тканевой хирургии, он должен был быть сформирован в пористый каркасный материал. Здесь необходимы два главных этапа. Во-первых, нужно разработать способ превращения полимера в объемный материал. Во-вторых, требуется способ сделать этот материал пористым.

Изготовление материала для тканевой инженерии

Правильный способ изготовления материала, или структурирования, частично зависит от химической природы полимера. Длинные, линейные, сатурированные полимеры, такие как PLGA, обыкновенно формируются в объемный материал переплетением отдельных полимерных цепей, чтобы образовать свободносвязанную полимерную сетку. Переплетение полимерной цепи часто достигается с помощью отливки полимера в форме. Таким образом, полимер расплавляется в растворителе, потом раствор заливается в форму или оболочку, впоследствии растворитель испаряется, оставляя полимер в виде объемного материала в форме оболочки. В качестве альтернативы, вливание полимера может осуществляться с помощью нагревания, давления или и того, и другого. Так, полимер помещается в форму, нагревается до своей температуры стеклования и с применением давления принимает форму оболочки. Преимущество этих способов в том, что они относительно просты. Однако, так как материал является упругим телом только из-за переплетенных полимерных цепей, в целом материалу недостает механической прочности. Этот недостаток трудно преодолеть без изменения химического строения полимера.

Еще один способ сформировать объемный материал из линейного полимера включает образование химических связей между полимерными цепями, известное как полимерное связывание. Связывание наиболее часто производится между ненасыщенными углерод-углеродными двойными связями, следовательно, эта составляющая, или другая, дающая аналогичную реакцию, должна существовать где-нибудь в полимерной цепи. Система инициации, обычно радикальная или ионная, также необходима для обеспечения связывания. Система инициации соединяется с полимером и, в ответ на импульс, такой как тепло, свет, химический ускоритель или просто время, инициатор образует продукт, распространяющий связывание. Так как эти полимеры сформированы в объемный материал с помощью ковалентного связывания, они обычно обладают значительной механической прочностью. Более того, их способность к затвердеванию в ответ на приложенный импульс позволяет вводить эти материалы в поврежденный участок, чтобы они затвердевали на месте. Важнейший недостаток связываемых материалов в том, что растущая сложность материала в условиях множества компонентов и наличия химической реакции часто ведет к проблемам с цитотоксичностью и биосовместимостью.

Также следует заметить, что отправная точка материала может не являться полимером, а может быть меньшей молекулой, такой как олигомер или мономер. С этими меньшими молекулами материал может формироваться с помощью инициации их полимеризации. Полимеризованные мономеры могут впоследствии сформировать объемный материал посредством переплетения длинных полимерных цепей в случае с бифункциональным мономером, или разветвления сеток в случае с мультифункциональными мономерами. Преимущества и недостатки, связанные с полимеризацией мономера, такие же, как с полимерным связыванием.

Методы, описанные выше, могут применяться как к гидрофобным, так и к гидрофильным полимерам. Основное преимущество гидрофобных полимеров, таких как PLA, над гидрофильными полимерами, такими как PEG, состоит в сравнительной прочности образуемого геля. Однако, гидрофобные полимеры в целом не могут использоваться для клеточной инкапсуляции, так как гель препятствует транспортировке воды, питательных веществ и отходов к клетке и из нее. Гели, образованные из гидрофобных полимеров, обычно используются в качестве каркаса, в котором клетки и ткани присоединяются к поверхности материала более чем внутри материала. Для применения в клеточной инкапсуляции особенно полезными являются гидрофильные полимеры (39, 46-51, 59-61). Эти полимеры образуют гель, который часто содержит до 90 % воды, что допускает значительную пассивную диффузию молекул в клетку и из нее. Высокое содержание воды, к сожалению, часто влечет за собой ухудшение механических свойств геля. В костной тканевой инженерии гидрогели могут использоваться в среде, не несущей нагрузок или в качестве компонента внутри каркаса, обладающего достаточно высокими механическими качествами. Выбор между гидрофильным и гидрофобным полимерами зависит, в основном, от рассматриваемой стратегии тканевой инженерии, а также от самих тканей.


Биомиметические материалы

Последние исследования сосредоточены на биомиметических материалах. Биомиметические материалы, созданные, чтобы более точно воспроизводить структуру внеклеточного матрикса, обычно являются гидрогелями, призванными особым образом взаимодействовать с определенным видом клеток таким образом, чтобы создать искусственную ткань, обладающую необходимыми свойствами. В целом, эти материалы впервые были получены путем создания материала, практически полностью предотвращающего клеточную адгезию. Далее, сигнальные молекулы, чаще всего короткие пептидные последовательности, полученные адгезией белков и участвующие в специфичной клеточной адгезии, ковалентно связываются с материалом. В результате получается материал, допускающий прикрепляться к его поверхности или проникать в его поры только особый вид клеток.

Очень важный фактор, который часто упускается из вида, это то, что первоначальный материал должен предотвращать случайную клеточную адгезию, чтобы окончательный материал обладал специфичной адгезией. Это часто достигается путем использования гидрогеля в качестве основного материала, так как считается, что гидрофильность гидрогелей предотвращает адсорбцию гидрофобных белков, необходимую для клеточной адгезии. Дополнительные факторы, определяющие успех этой стратегии, – объединение пептидной последовательности в наполнителе, более чем на поверхности материала, ограниченное расстояние, предоставленное пептидной последовательности, таким образом, становится возможно привязать ее к рецепторам поверхности клетки, и плотность пептидных последовательностей внутри материала. Наконец, дальнейшие исследования пептидных последовательностей, специфичных для адгезии отдельных клеточных популяций, необходимы для дальнейшего успеха этой методики.


Порообразование

После того, как была разработана методика превращения полимера в твердый материал, необходимо найти способ образования пористой структуры внутри материала. Самая простая методика – включение порогена в материал перед приготовлением, а после извлечь пороген. Объем, однажды заполненный порогеном, потом остается пустым, образуя поры внутри материала. Зная плотность материала и порогена, можно вычислить пористость, контролируя вес порогена относительно материала. Этот метод, известный как выщелачивание порогена, наиболее легко выполним с использованием порогена, растворимого в воде, такого как соль, сахар или крупицы желатина, который может быть извлечен замачиванием конструкции в воде. Принцип этого метода в том, что может быть собрано достаточное количество порогена, таким образом, отдельные поры соприкасаются друг с другом, образуя связанную пористую структуру внутри материала. Связанная пористость необходима не только для своевременного извлечения порогена, но и для создания каркаса для жизнеспособных тканей. Количество порогена, необходимое для соединяемости, зависит от материала и порогена, но обычно 70 % веса конструкции занимает пороген. Наконец, порогенный метод имеет то преимущество, что связанная пористость может быть достигнута простым измерением веса каркасной конструкции до и после извлечения порогена, если вес порогена, содержащегося в каркасной конструкции, равен весу, потерянному порогенным выщелачиванием, связанность достигнута.

Вторая основная методика формирования пористой структуры включает использование газа для образования пор внутри материала. Обычно газы, такие как азот или углекислый газ, вводят в состав объемного материала во время его приготовления, продувая материал газом или образуя газ как продукт химической реакции. Другой способ – образование пузырей замороженного растворителя, которые постепенно извлекаются испарением, чтобы получить пористую структуру материала. Опять же, основной принцип этого метода – объединение достаточного объема газа для формирования связанной пористой структуры.

В настоящее время разработаны более простые технологии создания каркасных структур с определенным строением. К настоящему моменту эти методы чаще всего используются для образования пористых каркасов, таких как описанный выше, для получения каркаса случайного строения. Это случайное пористое строение имеет два недостатка. Во-первых, оно сильно ухудшает механические свойства каркаса. Это ведет к необходимости создания материалов с очень высокими механическими качествами, чтобы полученный каркас мог использоваться в костной тканевой инженерии, а это ограничивает выбор применяемых материалов. Во-вторых, не менее важно то, что случайная пористость мешает серьезным исследованиям влияния каркасной структуры на образование тканей – проблема очень серьезная для костной тканевой инженерии. Ведущие методы создания каркасов с заданным строением включают в себя техники быстрого изготовления моделей, такие как трехмерное отпечатывание и стереолитография.


J.P. Fisher and A.H. Reddi, Functional Tissue Engineering of Bone: Signals and Scaffolds
Перевод Борисовой Марины