Розеткообразование мононуклеарных клеток с кальциофосфатами

Процесс остеоинтеграции кальциофосфатного (КФ) материала начинается с момента введения имплантата в организм. Однако имеющиеся в настоящее время методы в большинстве случаев позволяют получить информацию лишь о конечной стадии этого процесса или в абстрактном виде изучить отдельные механизмы взаимодействия КФ с, например, остеобластами или остеокластами в культуре ткани in vitro (Wang et al., 2000). Для исследования начальных этапов остеоинтеграции материала требуется использование других методологических подходов. В какой-то мере эту проблему можно решить с помощью прямого и непрямого методов розеткообразования (РО). Данный способ в различных вариациях и модификациях хорошо себя зарекомендовал в иммунологии (Петров и др., 1981; Гольдберг и др., 1992). На наш взгляд, эта техника еще не реализовала полностью свой потенциал и может быть использована в других отраслях биомедицины, в частности, в медицинском материаловедении при изучении первой наименее исследованной фазы остеоинтеграции, связанной с образованием непосредственных комплексов КФ с клетками-мишенями (прямая реакция РО). Другим вариантом является непрямая реакция РО, когда КФ предварительно опсонизируются тестируемыми биомолекулами с формированием комплекса КФ+белок (и)+клетка. В данной работе представлен адаптированный вариант техники прямой и непрямой реакции розеткообразования натуральных частиц кальциофосфатов с мононуклеарами периферической крови человека.

Клетки периферической крови получали от 12 здоровых доноров обоего пола в возрасте от 18 до 44 лет.

Выделение мононуклеаров периферической крови: 3 мл периферической крови человека смешивали с 6 мл фосфатного буфера Дульбекко без ионов кальция и магния (ISN), содержащего 50 ЕД/мл гепарина (Sigma), и перемешивали. 3 мл полученной клеточной суспензии наслаивали на 5 мл раствора фиколл-гипак [Ficoll (Sigma)][Hypaque (Pharmacia)] с плотностью р= 1,067 г/см³. Материал центрифугировали при 800 G в течение 15-20 мин. Интерфазный слой клеток, содержащий мононуклеары периферической крови, переносили в пробирку с 5 мл среды RPMI-1640 (ISN), перемешивали и центрифугировали при 800 G в течение 15-20 мин. Надосадочную жидкость удаляли, к осадку добавляли свежую порцию среды RPMI-1640, ресуспендировали и вновь центрифугировали. Супернатант удаляли. Выделенные мононуклеары периферической крови ресуспендировали в свежей среде RPMI-1640. Концентрацию клеток доводили до 10⁶/мл среды. 2-3 мл материала переносили в 35 мл чашки Петри (Falconi) и инкубировали в течение часа при 37 °С в СO₂ инкубаторе. Неадгезирующие к пластику мононуклеары собирали. С помощью 0,1% раствора трипанового синего (Serva) оценивали жизнеспособность клеток, а 0,2% нейтрального красного (Merck) - наличие в материале функционально активных (фагоцитирующих краситель) моноцитов и макрофагов. Жизнеспособность клеток составила 99,5±0,3%. Клеток, обладающих способностью фагоцитировать краситель, выявлено не было.

Общую характеристику мононуклеаров изучали с помощью непрямого иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител: CD-3, CD-4, CD-8, CD-16, CD-21. Часть материала обрабатывали меченными ФИТЦ моноклональными антителами. Затем с помощью люминесцентного микроскопа после проведения розеткообразования определяли фенотип реагирующих с частицами КФ клеток.

Кальциофосфатные материалы: получали из костей крупного рогатого скота путем обжига, удаления протеинов, измельчения, многократной промывки, высушивания, просеивания через сита уменьшающего диаметра и обжигом при 1350 ºС. Часть материала перед обжигом прессовали для получения дисков диаметром 12 мм и толщиной 1,2 мм с величиной пор 200-300 мкм. Из порошка выделяли частицы с диаметром 2-4 мкм методом ступенчатой фильтрации через мембраны («Сынпор») с диаметром пор 2,0 и 4,0 мкм. Концентрация частиц КФ доводилась до 10⁹/мл в фосфатном буфере. Для опсонизации частиц КФ белками крови человека, частицы инкубировали с сывороткой крови человека (20%) предварительно инактивированной прогреванием при 56° С в течение 30 минут, для удаления комплемента.

Фазы композиционного покрытия исследовались методом рентгенодифракционного анализа на установке ДРОН-4. Структурный анализ поверхности проводился с помощью металлографического микроскопа и сканирующего электронного микроскопа на продольных и поперечных срезах. Содержание микроэлементов исследовалось с помощью пламенно-фотометровой спектроскопии и трансмиссионной электронной микроскопии.

Эктопическое костеобразование: исследовалось на 55 мышах линии СВА. Одной части мышей под кожу имплантировали кальциофосфатные диски с диаметром пор 200-300 мкм. Другим животным на диски предварительно наносили столбик костного мозга, который извлекался из бедренной кости (клеточность -15х10⁶ клеток/мл) доноров в среде DI-MEM (ISN), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Через 1 месяц животные забивались эфиром, диски извлекались и подвергались морфометрическому, гистологическому и гистохимическому (кислая и щелочная фосфатазы) анализу. Часть препаратов оценивали с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Розеткообразование: частицы и клетки смешивали в соотношении 1:1 и оставляли на 1 час при 37 °С. Материал 2-3 раза отмывали бессывороточной средой D-MEM путем центрифугирования при 1500 об/мин. Затем суспензию клеток переносили в камеру Горяева и подсчитывали количество частиц КФ на 100 клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. Клетку считали розеткообразующей, если она несла на своей поверхности более 3 частиц. Затем часть материала переносили на предметные стекла, фиксировали в метаноле и окрашивали азур-II эозином. Индекс опосредованной адгезии определяли по формуле:

ИОА=(No-Nk) / Nk*100%

где No - количество клеток, адсорбирующих на своей поверхности частицы КФ в опытной группе; Nk - количество клеток, адсорбирующих на своей поверхности частицы КФ в контрольной группе.

По своему фазовому составу, согласно данным рентгеноструктурного анализа и сканирующей электронной микроскопии, кальциофосфаты состояли на 95,6% из гидроксиапатита и на 4,4% - из β-трикальциофосфата. Степень кристалличности гидроксиапатита (ГА) достигала 90%. Микроэлементы играют важную роль в формировании кристаллической решетки КФ и проявлении их биологических свойств. Нельзя исключить тот факт, что микроэлементы принимают активное участие в процессе взаимодействия КФ с клетками-мишенями. Содержание микроэлементов в КФ представлено в таблице.

Химический состав и содержание микроэлементов в КФ

Уровень токсичных элементов не превышал допустимые нормы. Отмечается относительно высокое содержание алюминия, кремния и калия. За исключением калия, маловероятно, что другие микроэлементы могут оказывать какое-то значимое биологическое влияние на состояние клеточной мембраны, отвечающей за адсорбцию КФ.

Анализ популяции мононуклеаров периферической крови показал, что они представляют собой гетерогенную популяцию как по своему фенотипу, так и по способности образовывать розетки с КФ частицами. В бессывороточной среде около 4,1% клеток обладали способностью к прямому взаимодействию с кальциофосфатами. Так как в среде отсутствуют вспомогательные молекулы, то механизм данного процесса может осуществляться через электростатические взаимодействия или хемосорбцию. Известно, что эти свойства КФ широко используются в хроматографии для выделения белков и нуклеиновых кислот (Urist et al., 1984; Brown, 1991).

Фенотип мононуклеаров периферической крови человека

Способность мононуклеаров периферической крови человека к образованию розеток с кальциофосфатными частицами (РОК) в среде с добавлением БСА и ЭТС

По морфологии эти клетки представляют собой мононуклеары. Около 80% из них не взаимодействуют с используемыми моноклональными антителами и относятся к группе недифференцированных клеток. Возможно, что они представлены незрелыми предшественниками для циркулирующих фагоцитирующих и стромальных клеток. Потенциально эти клетки могут играть важную роль в процессах интеграции материала с костной тканью, т.к. в процессе своей дифференцировки они формируют систему, которая, с одной стороны, участвует в остеогенезе, а с другой - в утилизации дефектного или стареющего костного матрикса (Grzesik, Robey, 1994).

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что после взаимодействия КФ материалов с биомолекулами сыворотки крови их способность к взаимодействию с мононуклеарами возрастает в 4,5 раза. При этом наряду с недифференцированными клетками с фенотипом CD 3-, CD 4-, CD 8-, CD 16-, CD 21- (5,1%) они вступают во взаимодействия с лимфоцитами имеющие хелперный CD 4⁺ (74,6%) и супрессорный CD 8⁺ (21,3%) фенотипы. Косвенно это подтверждает нашу концепцию о каскадоподобном механизме формирования костной ткани на КФ материалах. В первую очередь, речь идет о том, что после взаимодействия КФ с протеинами крови происходит усиление сигнала от заложенной в них информации, и они становятся более биоактивными. Возможно, что КФ селективно адсорбируют только определенные типы протеинов, необходимые для процесса остеоинтеграции. При этом механизм взаимодействия КФ с клетками осуществляется преимущественно за счет опосредованного механизма РО, с участием дополнительных протеинов (процесс перекодировки информации). Кроме того, образовавшийся активный комплекс способен взаимодействовать не только с недифференцированными мононуклеарами, являющимися потенциальными источниками циркулирующих остеогенных клеток, но и со вспомогательными клетками типа CD 4⁺ и CD 8⁺, являющимися Т-лимфоцитами, которые могут активно принимать участие в пластических процессах (Шахов, 1995; Бабаева, 1995; Shakhov et al., 1999).

В конечном счете, результатом первого этапа взаимодействия КФ с биомолекулами и клетками-мишенями является процесс построения костной ткани и остеоинтеграции. Его можно исследовать с помощью техники эктопического костеобразования (Karlov et al., 1999). Этот метод является аналитическим, так как позволяет изучить реакции, наблюдаемые со стороны имплантата, исключая влияния на этот процесс окружающих твердых тканей.

Изучение остеокондуктивных свойства тестируемых КФ показало, что при площади пористой поверхности 39,3±2,88 мм² площадь формируемой костной ткани составила 22,5 мм². Установлено, что остеоиндуктивные свойства проявляли не все поры. Оказалось, что площадь пористой поверхности составила около 39,3 мм². При этом засеянными костной тканью оказалось только 10,22 мм². Общая площадь вновь образуемой костной ткани составляла около 2,52 мм² (Karlov et al., 2001).

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что реакция прямого и опосредованного розеткообразования является достаточно простым и воспроизводимым методом, позволяющим получить информацию о первой фазе процесса остеоинтеграции, связанного с образованием комплекса КФ+био-молекулы+клетка.

В этот период закладываются основы тех биологических реакций, которые лежат в основе построения специфического костного микроокружения, обеспечивающего нормальную пролиферацию и дифференцировку остеогенных прекурсоров. Теоретически, могут быть использованы различные клетки-мишени, включая остеобласты, фибробласты, остеогенные прекурсоры и т.п.

Остеоиндуктивные свойства кальциофосфатной керамики (%)

С другой стороны, опсонизацию тестируемых частиц также можно осуществлять с помощью различных биомолекул, включая молекулы адгезии, структурные протеины, ростовые факторы и др. механизмы остеоинтеграции (Shakhov, Karlov, 2000).


А.В. Карпов, В.П. Шахов
Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики