Гипотеза о существовании механизма селективной эндогенной кристаллизации КФ в биологических системах

Согласно общей теории кристаллизации можно полагать, что в живом организме отдельные кристаллы кальциофосфата (КФ) могут выступать в качестве эндогенных зародышевых информационных центров (Вайнштейн, 1979; Воробьев, 1990; Karlov, Shahov, 2000, 2001; Le Geros, 1991). Причем, для того, чтобы более быстро наступил процесс образования кристаллических агрегатов метастабильные зерна, они должны иметь диаметр около 10-100 мкм. При этом аморфная часть КФ покрытия в кислой среде, вызванной воспалительной реакцией и некрозом костной ткани в месте введения имплантата, должна создавать критический уровень для построения новых кристаллических структур. Скорость кристаллизации можно ускорить за счет так называемого гетерогенного зарождения кристаллов, вызванного неоднородностью поверхности, например, за счет макро- и микропор и включения посторонних частиц. Выделяемые из КФ ионы кальция и фосфорных соединений приводят к локальному повышению их концентрации до величин, необходимых для эндогенной кристаллизации и (или) вторичного ядрообразования (эпитаксии). Кроме того, этот процесс может идти путем комбинации всех вышеперечисленных путей кристаллизации (Jarcho, 1980; Bruijn, 1993, Li, 1994, Bruijn et al., 1999).

В контекст вышесказанного входит понятие эпитаксии - ориентированного роста одного кристалла на поверхности другого или подложки (Палатник, Папиров, 1971; Воробьев, 1990). Эпитаксия начинается с возникновением на подложке отдельных кристалликов, которые коалесцируются (срастаются), образуя сплошную пленку. Подложка может иметь кристаллическую или аморфную структуру толщиной в несколько ангстрем. На одной подложке теоретически можно формировать пленки различного типа. Следует подчеркнуть, что если между двумя парами имеется структурно-геометрическое соответствие, как это имеет место в отношении гексагональной структуры кристаллов ГА, то пленка образуется более ориентированно, чем, например, если используется сталь или кобальт-молибденовые сплавы. Для костной ткани это касается ориентированного роста кристаллов апатита, направляемого кристаллографическими плоскостями волокон коллагена (Watson, Avery, 1954). Причем кристаллы КФ могут зарождаться как внутри волокон коллагена, так и вне них (Arsenault, 1988; Bruijn, 1993). В эксперименте in vitro было показано, что минерализация костного матрикса начинается с образования небольших шарообразных фокусов минерализации, периферия которых была положительна для ГАГов. Они были стохастически рассеяны по поверхности культуры, без видимой связи с волокнами коллагена. В фокусах минерализации отмечались веретенообразные кристаллы, состоящие по данным рентгеноструктурного анализа из КФ. Интересно, что рост и созревание фокусов минерализации проявлялись в наличии веретенообразных кристаллов по периферии. В центре кристаллы имели зернистую структуру. Когда минерализация продолжалась и размер фокусов минерализации увеличивался, они были поглощены волокнами коллагена, а иглообразные кристаллы КФ были выровнены параллельно к оси волокон коллагена. Судьба гранулярных кристаллов остается неясной (Bruijn et al., 1999).

Различают гетеро- и гомоэпитаксию. В первом случае вещества подложки и нарастающего кристалла различны, например, рост гидроксиапатита (ГА) на коррозирующем металле. Во втором - они одинаковы. Поскольку при разности геометрических параметров кристаллических решеток более 10% плоскость плотноупакованной решетки одного кристалла может не иметь продолжения в другой, края таких оборванных плоскостей в силу дислокационных несоответствий, как правило, образуют сетчатую структуру. Это подтверждают данные разных авторов, которые изучали расположение коллагеновых волокон на био- или металлокерамике (Чернов, Гиваргизов, 1988; Bruijn, 1993). По-видимому, это объясняет тот факт, что на поверхности имплантата с ГА покрытием одни авторы наблюдают образование кальций-фосфатов в виде перпендикулярного частокола, а другие исследователи не могли подтвердить этот феномен (Jarcho, 1981, Daculsi, 1999). Возможно, данное явление имеет характер артефакта. С другой стороны, использование более тонких методов обработки материала позволяет проследить формирование подобных структур.

Эпитаксия происходит так, чтобы суммарная энергия системы подложка-кристалл-маточная среда была минимальной. При этом чрезвычайно трудно определить центры кристаллизации, т.к. они маскируются под многослойные образования, имеющие псевдоморфизм, которые с помощью обычных методов выявить чрезвычайно трудно.

Сам механизм взаимодействия между ГА, коллагеном и искусственной подложкой не совсем ясен. Предполагается, что между ними устанавливаются ковалентные связи (ГА-аминокислоты) (Hartwing, Hench, 1977). Кроме того, процесс рекристаллизации кальциофосфатов может проходить на границе раздела биокерамики и ионов, выходящих из состава имплантата, с образованием новых кристаллов ГА или его карбоксильных форм (Daculsi, 1999). Кроме того, в нем могут участвовать другие макромолекулы (адгезины, интегрины, фибронектин, интерлейкины и т.п.) и сосудистая ткань, которые формируют остеоиндуктивное или остеокондуктивное микроокружение (Gross et al., 1981; Sela et al., 1981; Daculsi et al., 1988; Mann, 1989).

Одно из первых объяснений образования апатитного слоя на гидрокиси кремния за счет механизмов нуклеации, который представляет собой один из шагов образования кристаллов и кристаллитов (кристаллы без четкой структуры) предложил Walton в 1965-1967 годах. Считается, что существуют две первичные формы нуклеации: гомогенная и гетерогенная. Гомогенная нуклеация развивается в высоко концентрированных растворах в отсутствии инородных частиц и требует больших энергетических затрат. Гетерогенная нуклеация протекает на чужеродных субстанциях или частицах. Изменение энергии в обоих нуклеационных процессах может быть описано следующей формулой:

ΔGN = ΔG1 + ΔG₂, где ΔG1 связано с энергией, необходимой для образования кластера, a ΔG₂ - с энергией связывания ионов в кластере.

Для сферических частиц с радиусом r изменение энергии может быть описано следующей формулой:

ΔGN = 4πr²σ - 4πr³ΔG_v / (3V_m),

где σ - межповерхностная свободная энергия на единицу площади поверхности, ΔG_{V -} изменение свободной энергии на моль, связанное с изменением твердожидкой фазы, a V_m - молярный объем.

Изучение образование кристаллов КФ в модельных кальциофосфатных растворах может объяснить процессы минерализации тканей в биологических системах при использовании данных материалов в травматологии и ортопедии.

Взаимодействие между уровнем нуклеации и уровнем сверхнасыщения кальциофосфатами. 1 - гетерогенная, 2 - смешанная, 3 - гомогенная нуклеация

Резюмируя вышесказанное, можно сделать вывод о том, что коллаген и неколлагеновые белки экстрацеллюлярного матрикса кости выступают в роли инициаторов гетерогенной нуклеации. В какой-то мере между органической и неорганической нуклеацией можно провести определенные параллели. В обоих случаях происходит аккумуляция Са⁺⁺ и РO₄^3- за счет электростатических сил и химического взаимодействия. Однако в биоматериалах, например в титане или цирконии после зольгельной обработки, а также в биостеклах этот процесс идет через ОН- группы при рН=6,2-6,5, тогда как на золь-гель-алюминиевых материалах индукция апатитного слоя происходит при рН=8,0.

Зависимость между плотностью ОН^- групп на поверхности различных типов биоматериалов и способностью образования апатитного слоя представлена в таблице.

Корреляция апатитной формации с оксидированием (Li, 1993)

Образец	Изменение поверхности в кальцио-фосфатном растворе SBF7.4	Плотность ОН групп на поверхности	Образование апатитной формации
Силикогель	-	*****	Да
Кремниевые стекла	-	*	Нет
Кварц	-	*	Нет
Титан гель (анатаз)	-	*****	Да
Оксид титана (анатаз)	-	*	Нет
Гель алюминия	+	*****	Нет

Примечание: ***** - обильное количество ОН групп


Прямое подтверждение явления эндогенной кристаллизации было получено совсем недавно в работе G. Daculsi (1999). Он рассматривал процессы биодеградации бифазной кальциофосфатной керамики (БКФ), состоящей из ГА и β-ТКФ. Сначала происходят процессы биодеградации β-ТКФ с участием как процессов растворения, так и фагоцитоза макрофагами и остеокластами, а затем - ГА. Параллельно, после имплантации КФ, наблюдается образование микрокристаллов с отношениями Са/Р, аналогичными таковым кристаллов костного апатита. Развитие этих кристаллов было прямо связано с первоначальным отношением β-ТКФ/ГА в бифазной керамике. Чем выше отношение, тем больше распространенность микрокристаллов.

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕМ) недекальцинированных срезов границы раздела кость-бифазная керамика показала присутствие микрокристаллов, описанных как биологический апатит, отложенный перпендикулярно поверхности кристалла керамического ГА и связанного с волокнами коллагена. Используя ТЕМ с высоким разрешением, было продемонстрировано, что образование этих микрокристаллов после имплантации было, по-видимому, неспецифическим, т.е. не связанным с местом имплантации и типами КФ керамики. Микрокристаллы, связанные с биоматериалами, на основании ТЕМ и исследований дифракции электронов были описаны как апатиты, аналогичные биологическим апатитам, и определены как карбонатный гидроксиапатит (КГА). КГА кристаллы, связанные с КФ керамическими материалами, образуются, очевидно, в результате процессов растворения и осаждения. Частичное растворение кристаллов ГА и(или) β-ТКФ кристаллов керамики вызывает повышение концентрации КФ-ионов в непосредственном микроокружении имплантата до уровня пересыщения, приводя, в свою очередь, к осаждению новых кристаллов апатита, включающих другие ионы (СO₃^2-, Mg²⁺, НРO₄^2- и др.) из биологических жидкостей. Во время их образования и/или осаждения также наблюдался процесс эпитаксиального или гетероэпитаксиального роста (Daculsi, 1999).

Учитывая высокую гетерогенность КФ в минеральном матриксе костной ткани, нами была высказана гипотеза о том, что только часть этих минералов способна к селективному эндогенному образованию кристаллов КФ, необходимых для выполнения ими своих специфических биологических функций (Karlov, Shakhov, 2000).

Для проверки возможности образования кристаллов кальциофосфатов из определенных зародышевых центров, проводились модельные эксперименты, используя биологические жидкости, имитирующие естественную среду организма и содержащие кальциофосфаты, магний, натрий, калий, заменимые и незаменимые аминокислоты в концентрации, соответствующей таковой в межклеточной жидкости костных лакун.

Кальциофосфатные материалы выделялись из костной ткани крупного рогатого скота путем обжига и многоступенчатой очистки. Полученные кристаллы очищались путем фильтрации через полупроницаемые мембраны фирмы «Millipore» с диаметром пор 0,22-0,45 мкм с последующей гравитационной сепарацией в градиенте плотности, отмывкой и высушиванием. По данным рентгеноструктурного анализа, полученные кристаллы на 97% состояли из гидроксиапатита. Затем фракционированные частицы, используемые в качестве «зародышей», помещались в концентрированные синтетические среды (D-MEM, RPMI-1640) с повышенной концентрацией (10^х) минералов и кальциофосфатов и инкубировались в течение 1-30 суток при температуре 37 °С в СO₂-инкубаторе при 100% влажности и 5% СO₂. Образовавшиеся кристаллы концентрировались путем фильтрации с помощью мембран с диаметром пор 4 мкм и изучались посредством рентгеноструктурного анализа (РГА) и инфракрасной (ИК) спектроскопии. С помощью метода розеткообразования кристаллов с мононуклеарами периферической крови человека определялись уровень адгезии данных кальци офосфатов с или без предварительной опсонизации белками сыворотки крови. Из полученного материала изготавливались диски диаметром 12 мм и толщиной 2 мм, которые имплантировались под кожу мышам линии СВА на 1,2 месяца с или без нанесения столбика костного мозга, полученного от интактных животных, для выявления остеокондуктивных или остеоиндуктивных свойств КФ, соответственно.

В результате проведенных исследований было установлено, что только часть кристаллов КФ при помещении в синтетическую среду способна играть роль зародышей с образованием более крупных структур. Эти свойства во многом зависели от выбора среды, сроков и условия инкубации, качественного и количественного состава растворенных минеральных и органических молекул. После фазы экспансивного роста, длящегося 1-2 недели, наступал лаг-период, после чего рост кристаллов приостанавливался. Средние размеры кристаллов не превышали 5-10 мкм. Затем на их поверхности наблюдалась агрегация более мелких кальциофосфатных частиц с образованием многочисленных кластеров. Способность к росту проявляли только около 2-5% от всей массы исходных частиц (Karlov, Shakhov, 2000).

Нативный препарат суспензии кальциофосфатов, увеличение х40. Видны мелкие и крупные частицы. Последние имеют вытянутую форму

Нативный препарат суспензии кальциофосфатов, увеличение х40. Видны мелкие и крупные частицы. Наблюдается образование крупных кристаллов неправильной формы

Нативный препарат суспензии кальциофосфатов, увеличение 40х. Видны мелкие и крупные частицы. Вокруг крупных частиц наблюдается образование скопления более мелких частиц, с образованием агломератов (кластеров)

РГА и ИФ анализ показал, что по своему химическому составу эти кристаллы представляют собой одну из изоформ синтетических водорастворимых КФ с общей формулой:

M₁₀(ZO₄)₆Х₂,

где М - Са, Sr, Ва, Pb и др.; Z - P,V, As, Si, S и др., X - F, CI, Br, OH, О, которые по ряду характеристик (структура, растворимость) отличаются от обычного гидроксиапатита.

Возможно, они являются модифицированными ГА, ТКФ или иными КФ. Эти кристаллы обладают способностью к стимуляции процессов ОИ и ОК в модельных экспериментах на животных на 35-43% по сравнению с контрольными образцами, в качестве которых использовался мелкокристаллический ГА. Более мелкие кристаллы (0,22-0,45 мкм), представленные преимущественно ГА и трикальций фосфатом, проявляли более низкие биологические свойства (Karlov, Shakhov, 2001).

Полученные данные подтверждают выдвинутую нами гипотезу о существовании селективного механизма эндогенной кристаллизации КФ в биологических жидкостях. Причем, оказалось, что только 2-5% от всех КФ обладают этой способностью. Маловероятно, что этот процесс носит конкурентный характер. На первом этапе он идет за счет гомогенной, а позднее - гетерогенной нуклеации с образованием кластеров. Все это свидетельствует о принципиальной возможности создания в системе in vitro искусственных условий роста определенных кристаллов КФ, обладающих высокой биосовместимостью и биоактивностью (патент РФ № 2156325). Использование подобных технологий может стать альтернативным методом для разработки новых кристаллографических методик по созданию материалов с выраженными остеотропными свойствами для нужд травматологии и ортопедии.


А.В. Карпов, В.П. Шахов
Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики