Альтернативный источник стволовых клеток для тканеинженерных технологий в стоматологии

Capacity to proliferation and osteogenic differentiation of pluripotent mesenchymal cells of alveolar process periosteum, periodontal ligament and specimens of cancellous bone tissue was estimated during in vitro experiment. It has been concluded that all this types of cells are promising sources for application in maxillofacial and oral surgery.


В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии для возмещения костных дефектов все большее распространение находят технологии с использованием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Наиболее частыми источниками их выделения являются костный мозг и подкожная жировая ткань, что связано с дополнительной хирургической инвазией для пациента. Между тем, имеются данные, указывающие на наличие такого рода клеток и в различных тканях полости рта, доступ к которым можно осуществить при плановой хирургической санации ротовой полости. В частности, при удалении зубов верхней и нижней челюсти открывается доступ для получения материала, содержащего мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки - биоптатов губчатой кости (БГК), периодонтальной связки (ПС) и надкостницы альвеолярного отростка (НК), которые после пролиферации in vitro могут быть использованы для приготовления аутографтов. В настоящем сообщении приводятся предварительные результаты, обосновывающие такую возможность.

Материал для цитологических исследований был получен от 25 пациентов в возрасте от 19 лет до 61 года в виде фрагментов БГК (n=12), НК (n=10) либо ПС (n=3) с максимальным размером 10 мм. Образцы с соблюдением асептики переносили в пробирки («Corning», США) с кондиционной средой (5 мл), состоящей: среды DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) («ПанЭко», РФ), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («HyClon», США) и 200 ед/мл гентамицина. Пробирки с клетками центрифугировали при 200 g в течение 10 мин при 4°С, супернатант отбрасывали, а образцы переносили в новые стерильные пробирки и заливали новой порцией среды с высоким содержанием антибиотика. Пробирки энергично покачивали, достигая промывания образцов стерильной средой, затем снова центрифугировали. Эту операцию по промыву и смене пробирок повторяли не менее 5 раз. После последнего центрифугирования образцы стерильно переносили в чашки Петри («Corning», США) диаметром 3 см и заливали 1 мл среды.

Далее с помощью стерильных ножниц или стерильных щипцов в ламинарном шкафу (Babcock TVG 1.14.IS, ФРГ) образцы измельчали до размера не более 1-2 мм. Среду удаляли и заливали образцы средой того же состава, но добавлением коллагеназы 1 типа (Sigma, США) 1 мг/мл. Инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После этого фрагменты переносили в коническую пробирку, куда доливали 10 мл среды DMEM ЭТС, центрифугировали в течение 10 мин при 800 g при 4°С. Супернатант отбрасывали, осадок снова ресуспендировали в 10 мл среды с сывороткой, проводили повторное центрифугирование, после чего осадок ресуспендировали в 5 мл ростовой среды описанного состава с добавлением 10 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (ФРФ_о) (CellGenix, Германия) и помещали в культуральный флакон площадью 25 см² («Corning», США), который инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% углекислого газа в термостате (Sanyo МСО-15АС, Япония). Среду во флаконе меняли каждые 3-4 дня. По достижении клетками монослоя их пересевали используя трипсин («ПанЭко», РФ) или смесь трипсин/Версен («ПанЭко», РФ) по обычной схеме.

Клетки из тканей всех 3 типов исследовали на: способность к колониеобразованию - % колоний, содержащих более 16 клеток, при культивировании 100 клеток 4-ого пассажа; способность к индукции остеогенной дифференцировки - после инкубирования в кондиционной среде без ФРФ_о, содержащей 50 мкМ аскорбат-2-фосфата, 10 мМ (З-глицерофосфата и 0,1 мкМ дексаметазона с измерением размеров костных узелков; активность щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) по McGadey (1970) и способность экспрессированного матрикса к минерализации - выявлением Са ализариновым красным. Оказалось, что все три источника имеют сходные свойства при некоторой тенденции к более высокой способности к костеобразованию у клеток из периодонтальной связки и более низкой - из биопатов губчатой кости. Отмечено также уменьшение способности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток к костеобразованию с увеличением возраста донора.


¹Воложин Г.А., ²Докторов А.А., ³Десятниченко К.С., ¹Мкртчан Г.В.
¹Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет, ²ГЦ Медико-биологических технологий, ³НПО «ПОЛИСТОМ», Москва