Адгезивность эпителиоподобных клеток к хитозановым пленкам

Epithelial cells reveal different adhesive behaviour to chitosan membranes according to their origin.


В образовательно-научном институте наноструктур и биосистем Саратовского государственного университета разрабатываются биодеградируемые пленки из хитозана для выращивания клеток кожи в условиях in vitro с последующей трансплантацией на ожоговую рану.

Цель исследования.

Изучить адгезивные свойства эпителиальных по морфологии клеток млекопитающих эмбрионального и постнатального происхождения, а также клеток карциномы легкого человека к хитозановым плёнкам.

Материал и методы.

Для получения хитозановых плёнок использовали хитозан (М=81 к Да и СД=83.6 мольн. %) производства ЗАО «Биопрогресс» (Россия) и уксусную кислоту в концентрации С=2 мас. % квалификации х.ч. Пленки получали поливом растворов хитозана на специальные полиэтилентерефталатные подложки с последующим испарением растворителя. Формование пленки проводили при температуре Т=22±2°С и нормальном атмосферном давлении. Для перевода хитозана из солевой формы в форму основания плёнки выдерживали в 1 М NaOH, затем промывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе и стерилизовали УФ-светом в ламинарном боксе.

В качестве биологических объектов использовали культуры клеток карциномы легкого человека (А549), эпителия почки собаки (MDCK) и эпителия почки эмбриона макаки резус (МА-104) из коллекции НИИ вирусологии РАМН. Культивирование клеточных культур проводили в ростовой среде DMEM:F12 с 10%-ной эмбриональной сывороткой коров (ООО «Биолот», Россия) без добавления антибиотиков. Ферментативную дезагрегацию клеток проводили 0,25%-ным раствором трипсина с версеном в соотношении 3:1 при 37°С. На образцы пленок высевали клеточную суспензию из расчёта 250 тыс. клеток на см². Образцы инкубировали в условиях насыщающей влажности при 37°С в газовой среде с 5%-ным содержанием СO₂. Среду меняли на 2-3 сутки. Наблюдение за ростом клеток проводили в течение 9 суток. Контроль за процессом клонирования изучаемых культур эпителиальных клеток проводили с помощью инвертированного микроскопа «Биолам П», регистрацию изображений производили цифровой CCD-камерой DMC 300 (разрешение 3 Мрх).

Результаты.

Сравнительный анализ полученных результатов показал, что эффективность адгезии эпителиальных опухолевых клеток человека на предложенных образцах хитозановых пленок ниже, чем эпителиоцитов почек макаки и собаки. Так, клетки эмбрионального эпителия обезьяны макаки резус и почечного эпителия собаки образуют монослой на 4 и 7-е сутки культивирования соответственно, а эпителиоциты карциномы легкого человека не формируют полноценный монослой в течение 9 суток наблюдения.

Таким образом, эпителиальные клетки проявляют различную адгезивность к хитозановым плёнкам в зависимости от своего происхождения. В дальнейшем предполагается изучение возможности использования полученных образцов хитозановой пленки в качестве матрикса для выращивания эпителиоцитов кожи человека.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 09-03-12193 офим).


Бузинова Д.А., Хмельницкая Е.А., Шиповская А.Б., Островский Н.В., Пучиньян Д.М.
Саратовский Государственный Университет им. Н.Г. Чернышевского, г. Саратов