Использование ионной имплантации серебра в кальций-фосфатных (КФ) покрытиях для борьбы с инфекцией

Другой не менее актуальной проблемой является борьба с бактериальной инфекцией, которая может иметь место при использовании кальциофосфатов (КФ). КФ покрытия на металлические имплантаты активно внедряются в практику травматологии и ортопедии благодаря своей высокой биосовместимости и способности к остеоинтеграции (Мешков, 1996; Карлов и др., 1998, 1999, 2000; Moroni et al., 1998, 1999, 2000). Однако они обладают высокой способностью к адгезии белков, нуклеиновых кислот, клеток, в том числе бактериальных (Urist et al., 1984; Bruijn, 1993). Если первые факторы делают указанный материал высокобиоактивным, то последнее обстоятельство представляет собой серьезную проблему при практическом использовании КФ в практике, особенно при существующей возможности инфицирования раны.

В большинстве случаев применение антибиотиков или сульфаниламидных препаратов не приемлемо, так как эти субстанции быстро элиминируются из организма в результате биодеградации. Альтернативой антибиотикам и сульфаниламидам может быть ряд металлов. Антимикробное действие таких металлов как Au, Ag, Pt (т.е. благородных металлов) хорошо известно (Morton, 1977; Block, 1977). Из всех металлов, обладающих антимикробной активностью, наиболее популярным является серебро, поскольку оно обладает необычайно высокой биоактивностью при низких концентрациях. Это явление получило название олигодинамическое действие (Sparado, 1991). Кроме того, оно хорошо осаждается на кальциофосфаты и не подвержено растворению. В современной медицине для профилактики и лечения бактериальных инфекций обычно используют растворимые неорганические и органические соли серебра. Хотя указанные соединения эффективны в виде растворимых солей, они не обеспечивают продолжительной защиты, т.к. происходит их потеря вследствие вымывания или комплексообразования свободных ионов серебра. При этом серебро обладает выраженным цитотоксическим эффектом (Sheridan et al., 1995).

Электрохимический путь нанесения серебра для кальциофосфатов неприемлем, т.к. они являются диэлектриками. Другой способ решения данной проблемы за счет образования комплексных серебросодержащих соединений, обладающих низкой растворимостью, не нашел широкого применения в медицине из-за того, что интенсивность выделения серебра оказалась чрезвычайно низкой. Кроме того, такие покрытия имеют ограниченное применение вследствие проблем, связанных с адгезией, абразивной стойкостью и сроком годности при хранении. Часто оказывается неприемлем и способ активации поверхности металлического серебра с использованием тепла или химических реагентов. Подобные обработки ограничены материалом подложки, которая может быть покрыта и активирована таким методом. (Баррелл, Моррис, 1999). Данные авторы говорят о том, что сохраняется потребность в эффективном и недорогом антимикробном материале, обладающем следующими свойствами:

• длительно выделять антимикробный агент на терапевтическом уровне;
• быть приемлемым для широкого круга устройств и материалов;
• обладать необходимым сроком годности при хранении;
• проявлять низкую токсичность по отношению к клеткам млекопитающих.

Наиболее адекватным методом нанесения серебра является напыление вакуумными методами (Bunshah et al., 1984). В связи с этим нами была сделана попытка создать покрытие, содержащее ионы серебра, с оптимальным соотношением его цитотоксичного (по отношению к клеткам человека) и бактерицидного эффектов, позволяющим эффективно использовать их в практической медицине.

В качестве металлических имплантатов использовали титановые диски диаметром 12 мм марки ВТ1-0, на которые методом микродугового оксидирования наносилось кальциофосфат-ное покрытие. Затем с помощью ионной пушки в вакууме осуществляли имплантацию ионов серебра в 5, 7, 10 и 15 ат.% в поверхность на глубину не более 1-2 мкм. Полученные образцы промывались дистиллированной водой, высушивались и стерилизовались в сухожарочном шкафу в течение 1 часа при 180 °С.

Цитотоксический тест проводился с использованием мононуклеаров периферической крови, полученной от 3 здоровых доноров обоего пола в возрасте от 18 до 23 лет: 3-5 мл периферической крови смешивались с 5-6 мл фосфатного буфера Дульбекко без ионов кальция и магния (ISN), содержащего 50 ЕД/мл гепарина (Sigma), перемешивались, наслаивались на 5 мл раствора фиколл-гипак (Pharmacia) с плотностью р = 1,067 г/см³. Материал центрифугировался при 800 G в течение 15-20 мин. Интерфазный слой клеток, содержащий мононуклеары периферической крови, переносили в пробирку с 5 мл среды RPMI-1640 (ISN), перемешивали и центрифугировали при 800 G в течение 15-20 мин. Надосадочную жидкость удаляли, к осадку добавляли свежую порцию среды RPMI-1640, ресуспендировали и вновь центрифугировали. Выделенные мононуклеары ресуспендировали в свежей среде RPMI-1640. Концентрацию клеток доводили до 10⁶/мл среды. Затем 0,1 мл клеточной суспензии осторожно наносили на центр тестируемого диска, помещали во влажную камеру и оставляли при 37 °С на 1 час. В контрольной группе клетки помещали на кальциофосфатное покрытие без серебра. После чего клетки собирали, смешивали с равным объемом 0,1% раствора трипанового синего и подсчитывали в камере Горяева количество живых (неокрашенных) и убитых (окрашенных) клеток на 100 мононуклеаров.

Бактерицидный тест осуществляли со штаммами St. Auerus, Clostridium Perfriges, E. Coli по стандартной технологии в агаровой культуре с измерением зоны просветления (бактерицидности) вокруг дисков, которые помещали в чашки Петри (Бергер, 1982).

Результаты цитотоксического влияния ионов серебра на мононуклеары периферической крови человека и бактериальные клетки представлены в таблице. Установлено, что имплантация серебра в кальциофосфатные поверхности на титановом сплаве в дозе 15 и 10 ат.% серебра в поверхности покрытия вызывает гибель как бактериальных, так и мононуклеарных клеток. Концентрация 5 ат.% серебра по отношению к мононуклеарам обладает умеренным цитотоксическим действием, но не оказывает бактерицидного действия. Оптимальным соотношением цитотоксического и бактерицидного действия обладала концентрация 7 ат.% серебра (Karlov et al., 2000, 2001).

Цитотоксическое влияние кальциофосфатных материалов содержащих нитрат или хлорид серебра на периферические мононуклеары человека и St. Auerus, Clostridium Perfringes, E. Coli

По сравнению с другими бактерицидными металлами (медь, гафний, хром и др.) серебро является предпочтительным, так как при выбранной концентрации практически не влияет, в отличие от других металлов, на физико-химические характеристики кальциофосфатных покрытий (Студеникина и др., 1993; Sparado, 1991; Sheridan et al., 1995).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности создания кальциофосфатных покрытий, содержащих ионы серебра, внедренные в поверхность методом ионной имплантации, с оптимальным соотношением, позволяющим обеспечивать необходимые бактерицидные свойства при минимальном повреждении клеточных структур.


А.В. Карпов, В.П. Шахов
Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики