Сравнительное поведение ММСК и НСПК при трансплантации in vitro в органотипические культуры сетчатки

The functional rehabilitation of damaged retina in different cases of pathology with stem/progenitor sells transplantation is very actual. But it is difficult to predict the effects of such transplantation in vivo. That's why it is necessary to design models of damaged retina allowing to register the individual cell behavior after transplantation. Such model is the ex-plantation retina culture damaged by laser irradiation. This is model can help us in answering questions about the effective reparation time of laser damaged retina after NSPC and MMSC transplantation; minimal cell-migration time to the damaged area; optimal transplantation time; minimal number of transplanted stem cells required for migration at the distance up to 3 mm; necessity of neuronal micro surrounding for NSPC migration and optimal way of cell transplantation.


Одним из наиболее интенсивно развивающихся и перспективных направлений восстановления сетчатой оболочки глаза после травмы является трансплантация стволовых и прогениторных клеток. Современные представления о поведении трансплантированных стволовых клеток в нейрональных структурах при травме в быстрой направленной миграции трансплантата к месту повреждения отводят решающую роль регуляторным факторам, выделяемым гибнущими клетками. Однако данное представление базируется на исследованиях целого организма, что не позволяет детально рассмотреть динамику морфологических изменений трансплантированных клеток, не дает возможности проследить за судьбой отдельных клеток в реальном времени. В противоположность исследованиям in vivo, трансплантация клеток in vitro в эксплантационную культуру лишена этих недостатков. В связи с этим целью нашей работы было проведение трансплантаций GFP+ стромальных клеток костного мозга (ММСК) и нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК) в 3D культуру нейросетчатки глаза крыс Wistar.

Культивирование сетчатки проводили в стандартных условиях в среде DMEM/ F12 с 20 нг/мл FGF и EGF, 7% FCS, гепарином, добавками В12 и N2. На 7-е сутки эксплантаты повреждали лазером Zilos-tk (300 мВт 1000 мс) по квадрату со стороной 100 мкм (15 импульсов), и трансплантировали ММСК и НСПК из красного костного мозга большеберцовых костей и субвентрикулярной зоны мозга GFP+ мышей соответственно. Клетки выращивали в клональной плотности или в культуре висячих капель для получения агрегатов и трансплантировали стеклянным микрокапилляром в эксплантаты сетчатки в концентрации 300-300000 клеток в 0,2 мкл.

Было показано, что решающим для успешной миграции трансплантата к области повреждения является время, прошедшее после травмы. Через сутки НСПК распространялись преимущественно диффузно, в то время как при инъекции сразу после травмы наблюдалась направленная миграция 90% трансплантированных клеток в область повреждения эксплантата с области отдаленной от травмы на 600 мкм, 56% на расстояние 1000 мкм и 27% на расстояние, удаленное более чем на 3000 мкм. По мере продвижения к зоне повреждения, НСПК утрачивали способность к быстрому перемещению, выпуская длинные нейритоподобные отростки и приобретая морфологию биполярных нейронов и клеток глии под действием нового клеточного окружения эксплантата сетчатки глаза. Аналогичные изменения морфологии наблюдались и в трансплантированных ММСК, однако их распространение к области травмы происходило менее эффективно, чем НСПК. Миграция трансплантата наблюдалась в течение 3-х суток после инъекции. Концентрация трансплантированных ММСК оказывает сильное влияние на интенсивность их миграции, которая увеличивается с возрастанием плотности клеток при инъекции, минимальна 3x10² и максимальна при концентрации 3x10⁵. Отмечено распространение трансплантированных ММСК и НСПК преимущественно по клеточным элементам сетчатки глаза и практически полное отсутствие живых клеток на поверхности культуральной чашки. Пришедшие в область травмы клетки сохраняли свою жизнеспособность на протяжении более 30 суток. Однако на протяжении всего времени эксперимента экспрессия характерных маркеров дифференцировки нервных клеток, трансплантированными ММСК так и не была выявлена.

Таким образом, удалось детально проследить судьбу ММСК и НСПК при трансплантации в нейросетчатку глаза, показать решающую роль клеточного окружения для направленной дифференцировки и миграции трансплантата, показать временную и пространственную зависимость эффективности миграции клеток в область повреждения, оценить минимальное количество клеток, способное мигрировать на большие расстояния в область травмы.


¹Сергеев С.А., ^1,2Кошелева Н.В., ²Сабурина И.Н., ¹Семенова M.Л.
¹Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова; ²НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва