Способность магнитного носителя поддерживать развитие мезенхимальных стромальных клеток

Preliminary testing of magnetic scaffold, impregnated with magnetic nanoparticles for its ability to support proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells was carried out. Human mesenchymal stem cells from bone marrow were cultured within two types of magnetic scaffolds composed from hydroxyapatite and collagen/ hydroxyapatite (30:70 vt/vt) in osteogenic medium conditions during 15 days. Proliferation, viability, osteogenic markers expression was assessed on 5, 10, 15 days using MTT-test, acridine orahge/ethidium bromide staining, RT-PCR. No differences in the ability of magnetic scaffolds to support proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells were observed comparing with skaffolds not impregnated with magnetic nanoparticles. At the same time at initial period (up to 5 day) some inhibition of mesenchymal stem cells growth was observed in the collagen/hydroxyapatite scaffold that may be caused by cell adaptation to new conditions.


Цель.

Провести предварительное тестирование скаффолда, импрегнированного магнитными наночастицами, на предмет его способности поддерживать пролиферацию и остеогенную дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

Материалы и методы.

Скаффолды (СК) были получены в ISTEC-CNR (Фаенза, Италия). Для исследования были использованы 2 вида скаффолдов импрегнированные магнитными наночастицами (МНП) - на основе гидроксиаппатита и коллаген/гидроксиаппатита (30:70 в/в). Использовали культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека (ММСК), полученных из костного мозга, подвергнутую остеогенной дифференцировке по методике Kern S. et al. (2006). Цилиндрические СК объемом 0,5 мл были инфильтрированы клетками в конечной концентрации 5*10⁵/СК и помещены для инкубации в условия остеогенной среды. В качестве контролей использовали СК из тех же материалов не импрегнированные МНП. Для оценки морфофункциональных особенностей клеток в СК использовали стандартные методики окраски с использованием акридинового оранжевого (АО) и бромистого этидия (БЭ), тестирование активности алкалиновой фосфатазы, а также МТТ-тест (для количественной оценки жизнеспособных клеток и их пролиферативной активности). Было также проведено исследование экспрессии специфических генов остеогенной дифференцировки (OPN, Col I, Bsp II, Runx2) методом ОТ-ПЦР.

Результаты.

Эффективность создания тканеинженерных конструкций с использованием стволовых и прогениторных клеток во многом определяются микроархитектурой и природой «поддерживающего» материала (скаффолда). Недавно созданные т.н. «магнитные скаффолды», в частности, будут использованы для манипулирования клетками с использованием магнитного поля, поэтому одной из основных задач на предварительных этапах тестирования является оценка их способности поддерживать пролиферацию и направленное развитие клеточных элементов. В результате настоящего исследования было установлено, что обе тестируемые разновидности магнитных СК поддерживают активную пролиферацию ММСК и их остеогенную дифференцировку (по результатам теста с алкалиновой фосфатазой и экспрессии генов). Последнее было подтверждено после 10 дневной инкубации в условиях остеогенной среды. Тесты, характеризующие жизнеспособность и пролиферативную активность исследуемых клеток в образцах (окраска АО/БЭ и МТТ - тест) показали активную пролиферацию ММСК к 10-15 суткам культивирования, при этом различие с немагнетизированными контрольными СК было недостоверно. Однако было зарегистрировано, что в случае коллаген/гидроксиаппатитных СК до 5 суток культивирования прослеживалось ингибирование пролиферации клеток (по сравнению с контролем в МТТ-тесте) и отмечалось нарастание уровня нежизнеспособных (позитивных по бромистому этидию) клеток.

Вывод.

Не было выявлено существенных отличий в способности магнитных скаффолдов поддерживать пролиферацию и остеогенную дифференцировку ММСК (к 10-15-му дню инкубации) по сравнению со скаффолдами, не импрегнированными магнитными частицами при инкубации в условиях остеогенной среды. В то же время в инициальном периоде (до 5 суток) отмечалось ингибирование развития ММСК в коллаген/гидроксиаппатитовых СК, что возможно было связано с адаптацией клеток к новым условиям.


¹Горанов В.А., ²Руссо А., ²Панджери С., ³Дедиу В., ⁴Тампиери А., ⁴Ланди Е., ²Маркаччи М.
¹Белорусский Государственный Медицинский Университет (БГМУ), г. Минск, Беларусь, ²Институт ортопедии Ризолли, Болонья, ³Институт Наноструктурных материалов (ISMN-CNR), Болонья, ⁴Институт Технологий Керамических Материалов (ISTEC-CNR), г. Фаэнза, Италия.