Реакция стромальных стволовых клеток и мононуклеаров крови человека на биосовместимые материалы

Aim of investigation — research of in vitro cytokine secretion, processes of apoptosis and production of oxygen active forms (OAF) in cell cultures, topography and some parameters of artificial microterritories facilitating MMSC differentiation in osteogenous direction upon contact with implants coated by calcium-phosphate (CP) coatings. It was determined that cells regulating processes of acceptance/rejection of implants with different roughness were, first of all, blood mononuclear leukocytes. Upon contact with artificial surface, multipotent mesenchymal stromal cells actively show osteoblastic phenotype in the presence of structural-functional units (osteogenous microterritories).


Для биоинженерии тканей актуален вопрос о топографии и размерах ниш для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). При использовании медицинских изделий развивается воспалительная реакция, активность и исход которой модулируется не только местными стромальными элементами, но и циркулирующими во фракции мононуклеаров крови иммунными клетками.

Цель исследования.

Изучение in vitro секреции цитокинов, процессов апоптоза и продукции активных форм кислорода (АФК) в клеточных культурах, топографии и некоторых параметров искусственных микротерриторий, способствующих дифференцировке ММСК в остеогенном направлении при контакте с имплантатами с кальций-фосфатными (КФ) покрытиями.

Материалы и методы.

Применяли подложки из наноструктурного титана (диаметр 12 мм, толщина 1 мм), несущие двусторонние КФ покрытия, на которые наносили культуру пренатальных фибробластоподобных клеток легкого (источник ММСК) или мононуклеаров периферической крови человека, полученных центрифугированием на градиенте плотности 1,077 г/см³ Ficoll-Paque. Концентрацию TNFα, IL-2, IL-4 в супернатантах определяли с помощью наборов для ИФА. Морфологию окрашенных клеток на поверхности имплантатов исследовали с помощью РЭМ и оптической микроскопии в отраженном свете.

Результаты.

Согласно секреторной активности культуры клеток (остеокальцин, щелочная фосфатаза), ММСК, напрямую взаимодействующие с КФ дисками, получают преимущество в проявлении остеобластоподобной функциональной активности, по сравнению с культурой клеток на пластике. КФ шероховатые поверхности стимулируют формирование 3D-культуры фибробластоидных клеток человека. Клетки, позитивно окрашивающиеся на кислую фосфатазу, располагаются на сферолитах, клетки, воспринимающие щелочную фосфатазу (ЩФ, маркер остеобластов), заселяют углубления («ниши») искусственной поверхности. При этом «ниша» для индукции остеогенной дифференцировки ММСК человека является, по-видимому, структурно-функциональным понятием, выражающимся соотношением площади окраски клеток на ЩФ к площади занимаемой ею территории.

Тестируемые материалы обладают хорошей биосовместимостью на клеточном уровне, поскольку не вызывают увеличения апоптоза мононуклеаров крови и концентраций внутриклеточных АФК. Секреторная активность культуры фибробластоподобных клеток не зависела от шероховатости (Ra) КФ покрытий. В то же время, выявлена тесная связь Ra с секрецией мононуклеарами крови TNFα (r= -0,80; р=0,01; n=9), IL-2 (r=0,69; р=0,04; n=9) и IL-4 (r=0,83; р=0,006; n=9).

Выводы.

1. Клетками, регулирующими процессы приживления/отторжения имплантатов с разной шероховатостью, являются, в первую очередь, мононуклеары крови.
2. При контакте с искусственной поверхностью ММСК активно проявляют остеобластный фенотип при наличии структурно-функциональных единиц (остеогенных микротерриторий).
    

Исследование выполнено при поддержке ФЦП (госконтракт 02.512.11.2285 от 10.03.2009), гранта РФФИ № 09-04-00287а.


^1,4Хлусов И.А., ²Шаркеев Ю.П., ³Пичугин В.Ф., ²Легостаева Е.В., ⁴3айцев К.В., ^1,5Рязанцева Н.В., ^1,5Чечина О.Е., ¹Сазонова Е.В., ¹Биктасова А.К., ¹Хлусова М.Ю.
¹Сибирский Государственный Медицинский Университет, ²Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, ³НОЦ «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при ТПУ и СибГМУ, ⁴Томский филиал Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова Росмедтехнологий, ⁵НОЦ молекулярной медицины СибГМУ Росздрава, г. Томск