Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в кардиологии и травматологии

Директор государственного учреждения “Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В. К. Гусака НАМН Украины”, академик НАМН Украины В. К. Гринь и сотрудники института:
заместитель директора по научной работе, профессор А. А. Штутин,
ученый секретарь, старший научный сотрудник В. Ю. Михайличенко,
заведующий лабораторией клеточного и тканевого культивирования, доктор медицинских наук А. Г. Попандопуло,
заведующий отделением взрослой кардиохирургии и реабилитации, кандидат медицинских наук С. И. Эстрин,
старший научный сотрудник отдела кардиохирургии и реабилитации Е. М. Денисова,
старший научный сотрудник отдела термических поражений и пластической хирургии В. М. Оксимец,
врач-кардиолог отделения взрослой кардиохирургии и реабилитации Т. В. Кравченко
директор НИИ травматологии и ортопедии ДонНМУ им. М. Горького МЗ Украины, профессор В. Г. Климовицкий

Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в кардиологии и травматологии

Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для коррекции нарушений консолидации костей

В течение последних шести лет нашим институтом совместно с НИИ травматологии и ортопедии ДонНМУ им. М. Горького проводились исследования, направленные на изучение этиопатогенетических механизмов нарушения посттравматического репаративного остеогенеза, механизмов влияния МСК на процессы остеорепарации, индуктивных свойств различных клеточных носителей, на разработку технологий биологической остеогенной индукции МСК in vitro, создание трехмерного остеопрогениторного трансплантата, а также использование трансплантации аутоМСК при нарушениях репаративного остеогенеза и дефектах костной ткани.

Для определения факторов, приводящих к нарушению процессов остеорепарации, у 85 самцов белых крыс моделировали низко- (1 группа) и высокоэнергетические (2 группа) переломы берцовой кости. Гистологические исследования показали, что у животных 1 группы на 7-е сут после нанесения травмы в области перелома костная ткань имела значительное количество остеоцитов и образовывала примитивные костные балки, характерные для процессов образования костной мозоли.

Во 2 группе количество остеоцитов в костной ткани отломков было во много раз меньше, чем в 1 группе, причем остеоциты располагались преимущественно в участках, удаленных от линии перелома, а непосредственно возле перелома встречались единичные клетки. Признаков костеобразования в области повреждения кости у этих животных не отмечалось как на 7-е, так и на 14-е сут после травмы, а репаративные процессы проявлялись в виде формирования грубоволокнистой соединительной ткани, которая заполняла костную рану.

Результаты экспериментальных исследований in vitro показали, что у животных 1 группы в отличие от животных 2 группы пролиферация клеток надкостницы проходила равномерно вдоль всего костного фрагмента. У животных 2 группы в зоне, прилегающей к линии перелома, пролиферировали единичные клетки. Активная клеточная пролиферация отмечалась в зоне, наиболее удаленной от линии перелома.

Положительная реакция на щелочную фосфатазу (ЩФ) наблюдалась только у клеток периоста животных с низкоэнергетической травмой. При изучении пролиферации клеток эндоста наблюдали картину, схожую с пролиферацией клеток периоста.

При изучении МСК, выделенных из костно-мозгового канала травмированных сегментов, было отмечено, что у животных 1 группы количество МСК, адгезированых к пластику, было примерно в 10–12 раз больше, чем у животных 2 группы. Пролиферативная активность МСК на 14-е сутки культивирования у животных 1 группы была достоверно выше, чем у животных 2 группы. МСК формировали плотный монослой с клетками округлой формы, которые по своей морфологии напоминали эпителоидные клетки. МСК животных 2 группы образовывали субконфлуэнт, который по своей структуре напоминал субконфлуэнт, образованный клетками периоста животных этой же группы — одна часть клеток имела веретенообразную форму, а другая часть — звездчатую.

Обобщение результатов исследований свидетельствует о том, что на течение репаративных процессов в костной ране значительное влияние оказывает интенсивность, с которой травмирующий агент воздействует на костную ткань. При травмах низкой интенсивности репаративные процессы, развивающиеся в костной ране, приводят к образованию костного регенерата и сращению перелома.

При травмах высокой интенсивности в области перелома также протекают репаративные процессы, но они завершаются формированием неспецифической фиброзной ткани.

Одной из основных причин, нарушающих течение репаративного остеогенеза при травмах высокой интенсивности, являются морфофункциональные изменения клеточных источников остеорепарации, которые характеризуются дедифференцировкой остеогенно детерминированных клеток периоста и эндоста и утратой остеогенной детерминированности. Эти изменения периостальных и эндостальных источников остеорепарации приводят к тому, что пролиферирующие в костную рану МСК не получают остеогенной индукции и формируют вместо специфического костного регенерата неспецифическую рубцовую ткань.

Для изучения механизмов влияния МСК на остеорепаративный процесс в эксперименте in vitro изучали рецепторный аппарат клеточной мембраны МСК и продукцию цитокинов (ЦК) у некоммитированных и коммитированных по остеогенному пути МСК человека.

Данные иммуноферментного анализа супернатантов показали, что концентрация ЦК, продуцируемых МСК человека, зависит от сроков культивирования и клеточной дифференцировки. Аппроксимационный анализ динамики секреции ЦК МСК в процессе их пролифереции и дифференцировки показал, что при коммитации МСК по остеогенному типу происходило достоверное увеличение секреции ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-8 по сравнению с некоммитированными клетками. Продукция ИЛ-4 и ФНП-α как некоммитированными, так и коммитированными МСК оставалась практически на одном уровне, а продукция ИЛ-1β имела отчетливую тенденцию к увеличению.

В эксперименте in vivo изучали морфологические изменения, происходящие в области несрастающегося перелома при трансплантации МСК. В качестве модели несрастающегося перелома был выбран перелом берцовой кости, полученный в результате воздействия травмирующего агента высокой интенсивности.

Экспериментальные исследования были проведены на 21 животном (белые крысы). Трансплантацию МСК в область перелома осуществляли на 7-е сутки после нанесения травмы инъекционно (10 в четвёртой степени клеток/0,1 мл). Перед введением МСК клинически проверяли отсутствие сращения перелома.

После трансплантации МСК животных подразделили на две группы. Первую группу составили 14 животных, у которых после трансплантации иммобилизация конечности была продолжена, вторую группу — 7 животных без иммобилизации.

При изучении гистопрепаратов животных 1 группы, выведенных из эксперимента на 7-е сутки после трансплантации МСК, отмечали лизис бесклеточных участков костной ткани остеокластами и образование на их месте молодой костной ткани. Костный фрагмент был окружен значительным количеством мононуклеаров, часть из которых была представлена моноцитами. В межбалочных пространствах отмечали наличие значительного количества клеток-предшественников, находящихся на разных стадиях остеогенной дифференцировки — от преостеобластов до остеобластных клеток и клеток, завершающих свою дифференцировку в остеоциты. Все эти клетки активно продуцировали костный матрикс. Описанная гистологическая картина по своей сути напоминает процессы ремоделирования костной ткани.

Через две недели после трансплантации МСК в области трансплантации наблюдали наличие вновь образованной костной ткани (костного регенерата).

На гистоморфологических препаратах животных 2 группы наблюдали формирование молодой костной ткани возле краев костного фрагмента и хрящевой ткани в межфрагментарной области. Морфологически картина этой области напоминала гистогенез гиалиновой хрящевой ткани. В ткани наблюдали как малодифференцированные клетки, округляющиеся, увеличивающиеся в размере и пролиферирующие клетки, так и хондробластные клетки, формирующие изогенные группы.

Таким образом, данные гистоморфологических исследований свидетельствуют о том, что процессы, происходящие в области трансплантации МСК, направлены на восстановление остеорепаративного потенциала. Вначале некротизированный (бесклеточный) участок костной ткани подвергается лизису и ремоделированию, а затем запускаются остеорепаративные процессы и образование костного регенерата в области костного несращения. На процессы тканевой регенерации в области трансплантации МСК значительное влияние оказывает обездвиженность костных фрагментов. При достаточной иммобилизации несросшегося перелома в межфрагментарной области после трансплантации МСК формируется костный регенерат. При наличии подвижности костных фрагментов в области трансплантации МСК происходит формирование молодого гиалинового хряща.

Одним из важных вопросов клеточно-тканевых технологий является выбор клеточного носителя. Для исследования были выбраны материалы, сертифицированные в Украине и использующиеся в клинической практике: гидроксиапатит, образцы стеклокерамики “Остеоаппатит керамический”, биоимплантанты “Тутопласт” (ТП) и “Остеоматрикс” (ОМ).

Клеточные культуры прикреплялись к поверхности гидроксиапатита, но не распластовывались и не пролиферировали на нем, а со 2-й недели культивирования постепенно погибали и откреплялись в культуральную среду.

К поверхности трех видов образцов стеклокерамики с различным содержанием биогенного гидроксиапатита (30–68 %) клеточные культуры практически не прикреплялись и уже на 2–4-е сут после посева откреплялись в культуральную среду.

На “Тутопласте” клетки адгезировали, но их пролиферативная активность была незначительной, и концу 2-й недели ими было покрыто менее трети площади ТП, а в течение 3-й недели визуально клеточных пролиферативных процессов не отмечалось.

На "Остеоматриксе" наблюдали полную адгезию клеток, их активную пролиферацию и миграцию, к концу 2-й недели клетки занимали практически 90% площади ОМ, а к концу 3-й недели формировали плотный клеточный монослой.

Изучение гистопрепаратов носителей с культивированными МСК показало, что при использовании в качестве носителя “Тутопласта” происходило формирование клеточного скопления, формирующего слой из 25–35 клеток in vivo. Отмечались единичные участки, где МСК проникали в толщу носителя. В межтрабекулярных пространствах количество клеток было крайне незначительно, а структура самого носителя оставалась неизменной. Если в качестве носителя был использован "Остеоматрикс", то в формировании клеточного слоя принимало участие в 3–4 раза большее количество клеток. Они внедрялись в "Остеоматрикс", перерабатывали его и продуцировали свой собственный экстрацеллюлярный матрикс. В отдельных местах отмечалось формирование сосудов.

Таким образом, согласно данным исследований, наиболее оптимальным носителем клеточных культур является “Остеоматрикс”.

На основании данных изучения индуктивных свойств клеточных носителей и разработанной технологии биологической остеогенной индукции МСК была разработана и запатентована технология создания трехмерного остеопрогениторного трансплантата. Данный трансплантат, полученный в условиях in vitro, может рассматриваться как костный аутотрансплантат, который от обычного костного аутотрансплантата отличается значительно большим (в десятки раз) содержанием активно пролиферирующих остеогенных клеток-предшественников.

Трансплантацию МСК в виде суспензии осуществляли инъекционным методом при наличии нормо- и гипотрофических ложных суставов, а также длительно несрастающихся переломах, когда между костными фрагментами имелся щелевидный диастаз. Трансплантация осуществлялась после фиксации костных фрагментов поврежденного сегмента методом внеочагового чрескостного остеосинтеза. Суспензию МСК вводили строго в межфрагментарную область таким образом, чтобы она была вся инфильтрирована трансплантируемыми клетками.

При несросшихся переломах с наличием дефектов костной ткани трансплантацию МСК осуществляли в виде остеопрогениторного трансплантата и многокомпонентного коллагенового геля. Объем трансплантата определялся индивидуально у каждого больного.

Оперативное лечение проводили в два этапа.

В связи с тем, что во всех случаях отмечалось наличие различных угловых деформаций поврежденного сегмента, во время первого этапа оперативного лечения закрытым способом (без вмешательства в области несращения) при помощи аппаратов внешней фиксации устраняли угловые деформации и восстанавливали ось поврежденного сегмента.

Второй этап оперативного лечения осуществляли через 4–6 недель. Время выполнения данного этапа (которое у каждого больного было различно) зависело от скорости пролиферации клеточных культур.

Остеопрогениторный трансплантат плотно укладывали в реципиентное ложе между костными фрагментами и осуществляли фиксацию сегмента.

Трансплантация аутологичных МСК была выполнена 37 пострадавшим (35 мужчин и 2 женщины) в возрасте от 23 до 54 лет. При отборе больных основывались на следующих критериях: отсутствие консолидации перелома не менее 9 мес; минимум 2 раза осуществлялась попытка достичь консолидации перелома традиционным методом; наличие дефекта костной ткани, обусловленного воздействием травмирующего агента. Исследования проводились с соблюдением положений о биоэтике.

У 7 пациентов трансплантация была выполнена инъекционным методом, у 31 — оперативным методом (у 9 больных использовали многокомпонентный коллагеновый гель, у 21 — остеопрогениторный трансплантат и у 1 — комбинацию остеопрогениторного трансплантата и многокомпонентного коллагенового геля).

В качестве критерия оценки результатов использования клеточно-тканевых технологий у данных больных использовали двухбалльную систему. Удовлетворительными считали исходы, при которых после трансплантации наступало сращение костных фрагментов или в области дефекта кости происходило формирование костной ткани; неудовлетворительными — исходы, при которых после трансплантации сращение костных фрагментов не наступало или в области дефекта кости не происходило формирование костной ткани.

У всех пострадавших, за исключением одного, удалось достичь удовлетворительных результатов лечения. Анализ причины неудовлетворительного исхода лечения, на наш взгляд, связан с недостаточным количеством трансплантированных аутоМСК.

Подтверждением данного предположения может являться тот факт, что после повторной трансплантации аутоМСК в большем количестве у данного пациента наступила консолидация ложного сустава.

Средние сроки консолидации переломов у пострадавших с нарушением репаративного остеогенеза при использовании клеточно-тканевых технологий составили (17,2 - 5,1) недель, что достоверно меньше сроков отсутствия консолидации переломов у этих больных.

Данные клинических исследований дают нам право утверждать, что трансплантация аутоМСК при нарушениях репаративного остеогенеза и дефектах костной ткани обладает высокой клинической эффективностью, позволяет восстановить в костной ране нарушенные остеорепаративные процессы и сформировать в области дефекта новую костную ткань. Клиническая эффективность с учетом того, что одному больному для достижения удовлетворительных результатов потребовалось выполнение повторной трансплантации МСК, составляет 97,3 %.

Таким образом, клеточная терапия аутоМСК представляется новым направлением, открывающим широкую перспективу для разработки принципиально новых методов лечения широкого круга заболеваний, что требует объединения усилий институтов Национальной академии медицинских наук Украины.


“Журнал НАМН України”, 2011, т. 17, №1