Посттравматическая регенерация спинного мозга крысы в условиях эктопической экспрессии генов VEGF

Pathophysiological and pathomorphological aspects of spinal cord injury are well defined. However, adequate methods of spinal cord injury treatment are still absent. One of perspective approaches in this direction is cellular therapy. Mononuclear cells of human umbilical cord blood are intensively studied as a source of stem and progenitor cells for transplantations to posttraumatic and postishemic defects of a neural tissue and also for treatment of neurodegenerative diseases. They are characterized by the content of hematogenic stem cells, mesenchymal stem cells, progenitor endothelial cells and other cellular predecessors as well as by low immunogenicity, availability and simplicity of production. On a number of experimental models it was established that umbilical cord blood cells, producing the colony-stimulating factor 1, thrombopoetin and interlejkin-11, possess immunomodulatory ability. Effective delivery of neurotrophic factors into damaged area is also achieved by means of non-viral vectors - genetic make-ups expressing the therapeutic genes. For these purpose we used in our experiments the double-cassette plasmid, expressing genes of vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblast growth factor 2 (FGF₂). On the model of dosed contusion severity trauma of a rat spinal cord at level T8 we have studied effects of an immediate single injection into the damaged area of mononuclear blood cells from human umbilical cord and of plasmids, transfected by genes VEGF and FGF₂ (test group). The similar cells transfected by genes of green fluorescent protein (EGFP) in the same conditions and in the same quantity were injected to animals of control group. In a spinal cord of control group animals under injection of mononuclear blood cells from human umbilical cord, transfected by genes EGFP, the specific luminescence in transplanted cells is revealed on distance not less than 10 mm from an injection point. This luminescence is most intensive at early times after a trauma and injection of cells (2-6 days), is definitely detected at later dates (14-21 days) and gradually attenuates by 30 days. In animals of test group in external zones of white substance of spinal cord at distance of 1,5 cm from epicenter of a trauma the quantity of perivascular cells, expressing the beta-receptor of platelet growth factor (PDGFRbeta), increases on the average by 30% (P<0,05). The expression of genes VEGF and FGF₂ into the area of contusion trauma of a spinal cord leads to decrease of the area of destroyed gray and white substances, reduction of the total area of pathological cavities, increase of the number of myeline fibers in spinal paths as revealed by light microscopy morphometry, and to increase of the number of myeline fibers with diameter up to 2 microns according to electron microscopy data. The obtained results evidence that delivery of therapeutic genes VEGF and FGF₂ by means of cellular carriers stimulates vascularization of brain tissue and its posttraumatic regeneration.


Патофизиологические и патоморфологические аспекты травмы спинного мозга хорошо изучены. Однако адекватные методы лечения последствий повреждений спинного мозга отсутствуют. Одним из перспективных подходов в этом направлении является клеточная терапия. Мононуклеарные клетки крови пуповины человека интенсивно исследуют как источник стволовых и прогениторных клеток для трансплантаций при посттравматических и постишемических дефектах нервной ткани, а также для лечения нейродегенеративных заболеваний (Zhao et al. 2004; Kuh et al. 2005). Они характеризуются содержанием стволовых кроветворных, стволовых мезенхимных, прогениторных эндотелиальных клеток и других клеточных предшественников, а также низкой иммуногенностью, доступностью и простотой получения. На ряде экспериментальных моделей установлено, что клетки крови пуповины, вырабатывая колониестимулирующий фактор 1, тромбопоэтин и интерлейкин-11, обладают иммуномодулирующим действием, (Suen et al. 1994; Taguchi et al. 2004; Vendrame et al. 2004). Эффективную доставку нейротрофических факторов в область повреждения осуществляют также с помощью невирусных векторов - генетических конструкций, экспрессирующих терапевтические гены (Paper et al. 2006; Kang et al. 2008). С этой целью в наших экспериментах мы использовали двухкассетную плазмиду, экспрессирующую гены сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF₂).

Нами на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы, на уровне Т8 изучены эффекты немедленной однократной инъекции в область повреждения мононуклеарных клеток крови пуповины человека и плазмид, трансфицированных генами VEGF и FGF₂ (опытная группа). Животным контрольной группы в тех же условиях и в том же количестве вводили аналогичные клетки, трансфицированные геном зеленого флюоресцентного белка (EGFP). В спинном мозге животных контрольной группы с введением мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансфицированных геном EGFP, специфическое свечение в трансплантируемых клетках выявлено на расстоянии не менее 10 мм от точки инъекции. Это свечение наиболее интенсивно на ранних сроках после травмы спинного мозга и введения клеток (2-6 суток), четко прослеживается на более поздних сроках (14-21 сутки) и постепенно затухает к 30 суткам. У животных опытной группы в наружных зонах белого вещества спинного мозга на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы количество периваскулярных клеток, экспрессирующих бета рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFRbeta), возрастает в среднем на 30% (Р<0,05). Экспрессия генов VEGF и FGF₂ в области контузионной травмы спинного мозга крысы приводит к уменьшению площади разрушенного серого и белого вещества, уменьшению суммарной площади патологических полостей, увеличению числа миелиновых волокон в спинальных трактах по данным светооптической морфометрии и увеличению числа миелиновых волокон диаметром до 2 мкм по данным электронной микроскопии.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что доставка терапевтических генов VEGF и FGF₂ при помощи клеточных носителей стимулирует васкуляризацию ткани мозга и его посттравматическую регенерацию.


Шаймарданова Г.Ф., Рубашкина Я.О., Салафутдинов И.И., Ризванов А.А., Челышев Ю.А.
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казанский Государственный Медицинский Университет, Казанский Государственный Университет, г. Казань