Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фетальных нейральных стволовых клеток

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a new type of pluripotent cell which can be obtained by overexpression of few genes during reprogramming of different somatic cells. The aim of the study was to obtain human iPSCs from fetal neural stem cells without a genetic modification of genome. In our work reprogramming was carried out using a transient transfection of the human fetal neural stem cells with two plasmid vectors. The pCAG2LMKOSimO polycistronic vector carrying the mouse Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc gene cDNA in one case and the phOct4-IRES-DsRed2 plasmid containing coding region of the human OCT4 gene in the other case were used. As a result human iPSCs possessing all the properties of pluripotent cells were obtained. Thus, it has been shown that iPSCs can be obtained from fetal neural stem cells without a genetic modification of genome by transient expression of the only one gene, OCT4, and can be used in a range of fundamental and clinical studies.


Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) представляют собой новый тип плюрипотентных клеток, которые могут быть получены в ходе репрограммирования различных типов соматических клеток за счет сверхэкспрессии нескольких генов. Такие клетки по своим характеристикам и свойствам сходны с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) и могут быть использованы в различных фундаментальных и прикладных исследованиях, в том числе, в заместительной клеточной терапии заболеваний человека. Одним из основных ограничивающих факторов использования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в клинических исследованиях является «замусоривание» генома клеток чужеродной ДНК, особенно при использовании ретро- и лентивирусных векторов.

Целью данной работы было получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека из фетальных нейральных стволовых клеток (НСК) без генетической модификации генома. Репрограммирование было осуществлено в результате временной трансфекции НСК векторами двух типов. В одном случае был применен полицистронный вектор pCAG2LMKOSimO несущий кДНК генов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc мыши, в другом случае - плазмида phOct4-IRES-DsRed2, содержащая кодирующую часть гена ОСТ4 человека. На 9-й день после трансфекции были обнаружены первые колонии клеток морфологически сходные с ЭСК человека. Выделенные в ходе эксперимента клоны ИПСК человека, сходны с ЭСК по способу роста и морфологии, экспрессируют щелочную фосфатазу.

Иммуноцитохимический анализ показал, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека полученные из фетальных нейральных стволовых клеток экспрессируют маркеры ЭСК человека: транскрипционные факторы NANOG и ОСТ4, поверхностные антигены SSEA4, TRA-1-60 и TRA-1-81. ОТ-ПЦР анализ транскрипции 21-го гена показал, что полученные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки имеют сходный с ЭСК паттерн экспрессии генов. С помощью иммуноцитохимического окрашивания полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток эмбриоидных телец на экспрессию маркеров дифференцировки показали, что полученные нами индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека дифференцируются в производные трех зародышевых листков, что характерно для плюрипотентных клеток. Методом ПЦР было обнаружено, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученные с помощью плазмиды phOct4-IRES-DsRed2 не несут в геноме встроек плазмидной ДНК. Таким образом, было показано, что плюрипотентные клетки могут быть получены из фетальных нейральных стволовых клеток без генетической модификации генома, посредством временной экспрессии всего одного гена - ОСТ4 и могут быть использованы во всем спектре фундаментальных и клинических исследований.


¹Медведев С.П., ¹Григорьева Е.В., ¹Шевченко А.И., ¹Малахова А.А., ¹Дементьева Е.В., ¹Соболев И.А., Александрова М.А., ^3,4Плотников Е.Ю., ⁴Сухих Г.Т., ^1,53акиян С.М.
¹Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, ²Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва, ³НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, ⁴Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, ⁵Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, г. Новосибирск