Особенности культивирования камбиальных клеток роговичного эпителия

Aim of this research to develop technology of a harvest and growing allogenic stem cells of corneal epithelium from donors-corpses.

Donor materials have been harvested from eighteen donors eyes for growing corneal epithelium cells. Growth of corneal epithelium cells were received in both experimental groups. But in the second group, despite careful processing of donor eyes, the allogenic cellular material has appeared infected. In 77% cases the bacterial flora was resistant to antibiotics: gentamycin, vancomycin, lincomycin, ampicillin. The most activity, concerning the revealed microorganisms, in 92% cases possessed ciprofloxacin.

The technique of a material harvest during experiment allows to receive in enough stem corneal epithelium cells. The created standard conditions provide good growth and doubling of density of culture within three days. A donor material, which was harvest at donors corpses for growth corneal epithelium, more contaminate, than the cellular material taken at performance of surgical operation at live donors.


В последние годы многие авторы рассматривают трансплантацию культивированных стволовых клеток как наиболее перспективный метод, позволяющий влиять на ход репарации тканей организма человека. Одной из важных областей клинического применения культивированных клеток является лечение патологических изменений поверхностного эпителия роговицы глаза.

Цель данного исследования.

Разработать технологию получения и культивирования аллогенных лимбальных клеток от доноров-трупов.

Материал и методы.

Всего в двух группах было выполнено восемнадцать заборов донорского материала для культивирования клеток роговичного эпителия. В первой группе донорский материал забирали у пяти больных с посттравматическим увеитом. Участки лимбальной ткани толщиной от 100 до 200 мкм иссекали трепаном х1,0 мм во время выполнения энуклеации. Во второй группе донорский материал забирали у доноров-трупов в течение первых 12-18 часов после наступления смерти. После стандартной обработки глазного яблока в растворах антисептиков и антибиотиков по периметру лимба трепаном х1,0 мм иссекали 6-8 кусочков ткани толщиной от 100 до 200 мкм.

Фрагменты лимбальной ткани помещали в питательную среду с антибиотиками (ампицилин 5000 ед/мл, стрептомицин 5 мг/мл, гентамицин 10мг/мл) и транспортировали в лабораторию культивирования клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ. В лаборатории по стандартным протоколам выделяли клеточный материал и в последующем культивировали в пластиковых культуральных флаконах фирмы «Costar» объемом 50 мл в среде MEM.

Результаты.

Рост клеток роговичного эпителия получен в обеих экспериментальных группах. В первой группе удвоение плотности культуры происходило быстро, в течение первых - третьих суток. По форме культивированные клетки были однородно мелкие, кубоидальные, ядерно-цитоплазменный индекс приближался к значению 1:1. На втором этапе, через 5-7 дней культивации клеток при 37°С с содержанием 5% СО2, в подаваемом в инкубатор воздухе, осуществляли нанесение культуры эпителиальных клеток на матрицу диаметром 12 мм. В качестве матрицы использовали предварительно подвергнутую специальной физической и химической обработке силиковысушенную амниотическую мембрану. Полученную структуру помещали в питательную среду для сохранения до трансплантации.

Во второй группе, несмотря на тщательную обработку донорских глаз аллогенный клеточный материал оказался инфицированным. В структуре выделенных микроорганизмов превалировали Staphylococcus spp., а именно, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus aureus в 70% (n=9) случаев. В единичных случаях идентифицировались Enterobacter cloacae, Enterococcus durans, Kocuria varians. Грамотрицательных бактерий и грибов не выявлено.

В 77% (n=10) случаев бактериальная флора была резистентной к антибиотикам гентамицин, ванкомицин, линкомицин, ампицилин. Наибольшей активностью в отношении выявленных микроорганизмов в 92% (n=12) случаев обладал ципрофолоксацин.

Таким образом, отработанная в ходе эксперимента методика забора материала позволяет получить в достаточном количестве культуры клеток роговичного эпителия. Созданные стандартные условия обеспечивают хороший рост и удвоение плотности культуры в течение трех суток. Донорский материал при заборе у кадавров для культивирования клеток роговичного эпителия более контаминирован, чем клеточный материал, взятый при выполнении хирургической операции у живых доноров и требует совершенствования методов и средств для предварительной обработки кадаверных глаз.


¹Милюдин Е.С., ²Волова Л.Т., ²Россинская В.В., ¹Милюдин А.Е.
¹НИИ офтальмологии, ²Институт экспериментальной медицины и биотехнологий, ГОУВПО «Самарский Государственный Медицинский Университет Росздрава», г. Самара