Обработка и криоконсервирование пуповинной крови

The umbilical cord blood (UCB) is well known to be a rich source of stem cells with practical and ethical advantages, but it can be received only at childbirth. For better cell recovery, as the first stem cells preservation stage, all cord blood units were processed by using the Sepax automated method (Biosafe, Switzerland). To solve the problem of stem cells preservation, cryopreservation in liquid nitrogen is used. In Stem Cell Bank Pokrovski we used Planer controller freezer (Planer, UK) for optimal freezing conditions. The freezing program has been optimized for stem cells and the speed of freezing is from 1 to 3 К per minute, which avoids http://www.multitran.ru/c/m.exe?a=110&t=2317586_2_l&sc=28 cell damage. After freezing cord blood units were stored in the liquid nitrogen for further application. Data of cells recovery and viability of cord blood units after thawing suggested that the methods reported for processing and cryopreservation of hematopoetic stem/progenitor cells in the human UCB, used in Stem Cell Bank Pokrovski, is effective.


Цель исследования.

Использование пуповинной крови как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток для лечения онкогематологических и ряда других заболеваний получает сегодня всё большее распространение. Для максимально успешного применения стволовых клеток пуповинной крови (СКПК) при трансплантации необходимо, чтобы образец СКПК отвечал определенным требованиям к качеству. Одним из ключевых этапов заготовки СКПК является криоконсервирование. Разработка стандартных процедур по сбору, выделению, оценке, криоконсервированию и хранению стволовых клеток пуповинной крови в банке пуповинной крови позволит эти требования соблюсти.

Материалы и методы.

Оценивались 708 образцов пуповинной крови, собранных во время родов до рождения плаценты. Мононуклеарная фракция выделялась автоматическим способом на клеточном сепараторе Sepax S-100 (Biosafe, Швейцария). Эффективность выделения ядерной фракции и фракции мононуклеаров оценивались при помощи гемоанализатора «Bechman&Coulter», количество и жизнеспособность CD34⁺ клеток оценивалась на проточном цитометре «Bechman&Coulter» FC500. После отбора проб для проведения необходимых анализов и добавления криопротектора - 10% диметилсульфоксида («Pall») образцы помещались в программный замораживатель Planer KRYO 560-16 (Planer, Великобритания) где проводилась криоконсервация по разработанному нами протоколу от +4еС до -100еС после которой образцы пуповинной крови перемещались в криохранилища для хранения в жидкой фракции азота при температуре -196еС. Для оценки эффективности выделения и криоконсервации ядерной фракции, через 1 год были разморожены 7 образцов и оценено количество ядерных клеток, количество и жизнеспособность CD34⁺ клеток.

Результаты.

Процент выделения ядерных клеток и мононуклерных клеток составил 84,63±19,3% и 77,9±21,7% соответственно, среднее значение абсолютного количества CD34⁺ клеток в образце - 22,2x10⁵ клеток, доля жизнеспособных клеток мо нонуклеарной фракции составила 99,31%. После размораживания доля от выделенных ядерных клеток и CD34⁺ клеток составила 95,5±3% и 85,2±23% соответственно, а доля жизнеспособных мононуклеарных клеток снизилась до 85,9%.

Выводы.

Использование для выделения лейкоцитарной фракции автоматической системы Sepax S-100 позволяет получать образцы с высоким содержанием клеток. Применяемый нами протокол программного замораживания обеспечивает сохранность большого количества клеток в жизнеспособном состоянии. В целом, используемая методика сбора и обработки пуповинной крови позволяет помещать на хранения в банк пуповинной крови образцы высокого качества, соответствующие предъявляемым требованиям.


Иволгин Д.А., Коровина К.В., Адылов Ш.Ф., Смолянинов А.Б., Цымбалюк И.Н.
Покровский Банк Стволовых Клеток, Санкт-Петербург