Изучение влияния клеток Ито печени на стволовые клетки

Intercellular communication might be realized by paracrine secretion and direct cell-to-cell contacts. It is known that hepatic perisinusoidal cells (HPC) establish regional stem cells niche and determine their differentiation. At the same time HPC remain poorly characterized on molecular and cellular level.

The aim of project was to study interactions between rat hepatic perisinusoidal cells and various stem cells such as mononuclear cell fraction of human umbilical cord blood (UCB-MC) and rat bone-marrow derived multipotential mesenchymal stromal cells (BM-MMSC).

Materials and methods. Rat BM-MSC and HPC, human UCB-MC cells were derived using standard techniques. To study HPC paracrine regulation we co-cultured UCB-MC or BM-MMSC cells with HPC using Boyden chambers and conditioned HPC cells media. Differentially labeled cells were co-cultured and their interactions were observed by phase-contrast fluorescent microscopy and immunocytochemistry.

Results. During the first week of cultivation there was autofluorescence of vitamin A because of fat-storing ability of PHC. BM-MMSC demonstrated high viability in all co-culture models. After 2 day incubation in conditioned media co-culture of BM-MMSC with HPC we observed changes in morphology of MMSC - they decreased in size and their sprouts became shorter. The expression of α-Smooth Muscle Actin and desmin was similar to myofibroblast - an intermediate form of Ito cells culture in vitro. These changes could be due to paracrine stimulation by HPC. The most profound effect of HPC on UCB-MC cells was observed in contact co-culture, thereby it is important for UCB-MC cells to create direct cell-to-cell contacts for maintaining their viability. We did not observe any cell fusion between HPC /UCB and HPC /BM-MMSC cells in co-cultures. In our further experiments we plan to study growth factors produced by HPC for hepatic differentiation of stem cells.


Введение.

Особый интерес среди многообразия клеток печени представляют перисинусоидальные клетки печени (клетки Ито). Благодаря секреции факторов роста и компонентов межклеточного матрикса они создают микроокружение гепатоцитов, а в ряде научных исследований была показана способность звездчатых клеток печени к формированию микроокружения для прогениторных клеток (в том числе, гемопоэтических) и влиять на их дифференцировку в гепатоциты. Межклеточные взаимодействия этих популяций клеток могут осуществляться путем паракринной секреции факторов роста или непосредственных межклеточных контактов, однако молекулярные и клеточные основы этих процессов остаются до конца неизученными.

Цель исследования.

Изучение механизмов взаимодействия клеток Ито с гемопоэтическими (ГСК) и мезенхимальными (ММСК) стволовыми клетками в условиях in vitro.

Материалы и методы.

Клетки Ито печени крыс выделены двумя различными ферментативными методами. Одновременно из костного мозга крыс получены стромальные ММСК. Мононуклеарная фракция гемопоэтических стволовых клеток выделена из пуповинной крови человека. Паракринные влияния клеток Ито были исследованы при культивировании ММСК и ГСК в среде, в которой росли клетки Ито, и при совместном культивировании клеток, разделённых полупроницаемой мембраной. Влияние межклеточных контактов было изучено при совместном ко-культивировании клеток. Для лучшей визуализации каждая популяция была мечена индивидуальной флуоресцентной меткой. Морфологию клеток оценивали методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии. Фенотипические признаки культивируемых клеток изучали методами иммуноцитохимического анализа.

Результаты.

В течение недели после выделения перисинусоидальных клеток нами отмечена способность их к аутофлюоресценции благодаря жиронакапливающей способности. Далее клетки перешли в промежуточную фазу своего роста и приобрели звёздчатую форму. На начальных этапах ко-культивирования клеток Ито с ММСК костного мозга крысы жизнеспособность ММСК сохранялась во всех вариантах культивирования. На вторые сутки при культивировании ММСК в культуральной среде клеток Ито происходило изменение морфологии ММСК - они уменьшались в размерах, отростки укорачивались. Экспрессия альфа-гладкомышечного актина и десмина в ММСК увеличивалась, что свидетельствовало об их фенотипическом сходстве с миофибробластами - промежуточной стадией роста активированных клеток Ито in vitro. Полученные нами данные свидетельствуют о влиянии паракринных факторов, выделяемых клетками Ито, на свойства ММСК в культуре.

На основании ко-культивирования кроветворных стволовых клеток с клетками Ито показано, что гемопоэтические стволовые клетки сохраняют жизнеспособность только при контактном ко-культивировании с клетками Ито. По данным флуоресцентного анализа смешанных культур феномен слияния клеток разных популяций выявлен не был.

Выводы. Для сохранения жизнеспособности кроветворных стволовых клеток решающим фактором является наличие непосредственных межклеточных контактов с клетками Ито. Паракринная регуляция была отмечена только при культивировании ММСК в питательной среде, в которой росли клетки Ито. Изучение влияния конкретных факторов, вырабатываемых клетками Ито, на дифференцировку ГСК и ММСК в культуре клеток планируется провести в следующих исследованиях.


Шафигуллина А.К., Трондин А.А., Шайхутдинова А.Р., Калигин М.С., Газизов И.М., Ризванов А.А., Гумерова А.А., Киясов А.П.
ГОУ ВПО «Казанский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»