We show highly efficient transfer of a newly-constructed bicistronic lentiviral plasmid pHR-CMV-DRep into human bone marrow multipotential mesenchymal stromal cells (BM-hMMSC). Genetically modified BM-hMMSC sustain stable expression of transgenes for at least four weeks of cultivation. We also demonstrate the ability of genetically modified BM-hMMSC to differentiate along hepatic lineage as revealed by tests for glycogen storage and expression of specific genetic markers.
Способность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ), жировой ткани и пуповинной крови дифференцироваться в гепатогенном направлении в перспективе может быть использована для лечения заболеваний печени. Помимо клеточной терапии широко обсуждают возможность применения генной терапии различных заболеваний в клинике. Применение ММСК в качестве клеточных векторов сдерживает низкая эффективность стандартных методов трансфекции в применении к ММСК. Лентивирусные вектора обеспечивают высокую частоту трансдукции, стабильную интеграцию трансгена в хромосомальную ДНК; для них менее характерно эпигенетическое подавление экспрессии трансгена; лентивирусные векторные системы второго и третьего поколений включают целый комплекс модификаций и улучшений, гарантирующих их безопасность.
Целью работы было оценить эффективность генетической модификации ММСК КМ человека бицистронным лентивирусным вектором pHR-CMV-DRep, устойчивость экспрессии репортерных генов с данного вектора в условиях гепатогенной дифференцировки ММСК КМ, влияние генетической модификации ММСК КМ на их гепатогенный потенциал.
Нами сконструирован лентивирусный вектор доставки pHR-CMV-DRep второго поколения, содержащий бицистронную экспрессионную кассету, предназначенную для внутриклеточного синтеза двух репортерных белков eGFP и DsRed1 под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса человека. С использованием данного вектора получены рекомбинантные лентивирусы, псевдотипированные гликопротеином вируса везикулярного стоматита. Методами проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии показана высокая эффективность переноса и экспрессии белков-репортеров в ММСК КМ человека (64.5±6.5%). Установлено, что экспрессия белков-репортеров в трансдуцированных клетках стабильна на протяжении не менее одного месяца их культивирования in vitro.
Проведена гепатогенная дифференцировка ММСК КМ человека, трансдуцированных вектором pHR-CMV-DRep, под действием EGF, FGF-4, HGF, никотинамида, дексаметазона, ITS+. Показана стабильная экспрессия репортерных генов eGFP и DsRed1 в ММСК КМ по истечении трех недель дифференцировки. ММСК, подвергшиеся дифференцировке, окрашивались на наличие внутриклеточного гликогена. Различия по накоплению гликогена между модифицированными и немодифицированными ММСК после трех недель гепатогенной дифференцировки не установлены. Был проведен анализ наличия в дифференцированных ММСК транскриптов тканеспецифических маркеров (альбумин, щелочная фосфатаза и др.) методом ПЦР в реальном времени. Анализ показал наличие данных маркеров в образцах РНК, выделенных из дифференцированных ММСК. При этом не было обнаружено отрицательного влияния генетической модификации ММСК вектором pHR-CMV-DRep на уровни экспрессии специфических маркеров гепатогенной дифференцировки.
Таким образом, нами показана высокая степень эффективности генетической модификации ММСК КМ человека бицистронным лентивирусным вектором pHR-CMV-DRep, а также стабильная экспрессия репортерных белков eGFP и DsRed1 в ММСК на протяжении одного месяца. Генетическая модификация ММСК КМ человека данным вектором не повлияла на их гепатогенный потенциал. При этом в условиях гепатогенной дифференцировки сохранялась устойчивая экспрессия репортерных генов в ММСК КМ.
1Северин И.Н., 2Гринев В.В., 2Посредник Д.В., 1Космачева С.М., 1Потапнев М.П.
1Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии, 2Белорусский государственный университет, г. Минск, Беларусь