Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека

The potential of multipotential mesenchymal stromal cells (MMSCs) of human bone marrow to differentiation into insulin-producing cells was under study. MMSCs were seeded in flaks with or without extracellular matrix gel and 15-day 3-step protocol was used. Differentiation was detected by morphology characteristics, C-peptide production, intracellular insulin presence and mRNA expression of pancreatic endocrine genes. As a result of cell differentiation was estimated only few MMSCs differentiated into insulin-producing cells in vitro. Additional investigations are required for MMSC therapy of type 1 diabetes.


Мультпотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) под действием ростовых факторов могут дифференцироваться в различные типы клеток. В последнее время появился ряд сообщений, демонстрирующих трансдифференцировку ММСК в инсулин-продуцирующие клетки (ИПК).

Цель работы.

Изучение возможности дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека в инсулин-продуцирующие клетки.

Материалы и методы.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки получали методом адгезии на пластике из мононуклеаров костного мозга, выделенных на градиенте плотности 1,077 Ficoll - Paque. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки культивировали в среде альфа-MEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), глутамин и антибиотики. Смену среды проводили каждые 4 дня. Дифференцировку ММСК 3-его пассажа в ИПК проводили при достижении клетками 90% конфлюэнтности роста по трехступенчатому протоколу предложенному Gao F. с соавт. (2008). Контролем служили ММСК, культивированные в среде L-DMEM с 10% FBS. Часть ММСК после дифференцировки переводили на среду L-DMEM: DMEM F12 (1:1), содержащую FBS и эксцендин-4, с целью выявления внутриклеточного цинка (Tayaramma Т. 2006). Оценку дифференцировки ММСК в ИПК проводили по образованию трехмерных клеточных кластеров, содержанию внутриклеточного цинка (окраска дитизоном), количеству С-пептида в питательной среде (ИФА), экспрессии генетических маркеров PDX-1 и ISL-1 иммунофлуоресцентным методом и проточной цитофлуориметрией, по наличию транскриптов препроинсулина (PPI), транскрипционного фактора PDX, прогормонконвертаз РС1/3 и РС2 методом ПЦР в реальном времени.

Результаты.

Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на протяжении 15-ти дней в условиях 3-х ступенчатого протокола не привело к появлению выраженных морфологических и функциональных признаков, характерных для ИПК поджелудочной железы. Так, клетки, подвергнутые дифференцировке, не экспресссировали mRNA PDX-1, PPI, РС1/3 и PC2, а, наблюдавшееся изменение морфологии клеток в округлую форму на 2-ой ступени протокола не завершилось образованием трехмерных кластеров, сходных с островками Лангерганса поджелудочной железы. Однако по ряду свойств ММСК, подвергнутые дифференцировке, отличались от контрольных клеток. Через 48 часов культивирования в среде определялось незначительное количество С-пептида, а с помощью окраски дитизоном были выявлены области с положительной реакцией на внутриклеточный цинк (не более 10 ед. на флакон Т25). Кроме того, 2,76% клеток, переведенных после дифференцировки на 10 дней в среду L-DMEM: DMEM F12, содержащую 10% FBS и 10 нмоль/л эксцендина-4, экспрессировали PDX-1.

На основании результатов собственных исследований и анализа публикаций, преждевременно говорить о возможности полноценной и эффективной β-клеточной дифференцировки ММСК. Требуются дополнительные исследования по разработке методик получения ИПК, а также по генетической модификации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro с возможностью достижения регулируемой секреции инсулина этими клетками.


Игнатенко С.И., Згурская Н.А., Космачева С.М., Потапнев М.П.
Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии, г. Минск, Беларусь