Дедифференцировка культивируемых клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека

The dedifferentiation is one of approaches for stem or progenitor cells generation for cellular therapy. In this study the differentiation states of cultured adult human retinal pigment epithelium (ahRPE) cells was established. In PCR of native ahRPE cells, monolayer and spheroid-like colonies of cultured primary and subcultived ahRPE cells the expression of the pluripotent markers, such as Nanog, Oct4 and Pax-6 were detected. Immunocytochemical analysis of cultured ahRPE cells showed expression of Pax-6 which involved in the development of structures, usually derived from ectodermal tissues. Moreover our findings demonstrate that mature human RPE cells have the capacity to express a neuron-associated gene in response to conditions that promote dedifferentiation.


Дедифференцировка соматических клеток является одним из возможных путей получения стволовых клеток для терапевтических целей.

Целью исследования явилось изучение дифференцировочного потенциала ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза взрослого человека в культуре.

Материалы и методы.

Ретинальный пигментный эпителий выделяли из глазных яблок, полученных при аутопсии от 27 доноров в возрасте 24-73 лет. Первичную культуру выращивали на сывороточной среде в пластиковых флаконах площадью 25 см². Субкультивирование проводили на двух альтернативных средах, сывороточной и бессывороточной. Бессывороточную среду использовали для получения сфер в суспензионной культуре. Для ИЦХ характеристики культур использовали: Рах6, CD133, нестин, β-тубулин-III, нейрофиламенты (NF), глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), N-кадгерин, коннексин-43, RPE65, клеточный ретиналдегид-связывающий белок (CRALBP), Recoverin, Factor Von Willebrand, hSTRO1, коллаген I типа, фибронектин (FN), α-гладкомышечный актин (α-SMA), Ki67. При ПЦР культур РПЭ исследовали сигнальные белки (TGFbeta2, PEDF), транскрипционные факторы (Oct4, Nanog, Рах6, Pitx2, FoxC1, Prox1) и маркеры дифференцировки (RPE65, Recoverin, Nestin, β-tubulin-III, Musashi 1, GFAP, NS).

Результаты.

Клетки ретинального пигментного эпителия in vitro активно пролиферировали, мигрировали, депигментировались, приобретали веретенообразную форму. При ИЦХ клетки ретинального пигментного эпителия теряли маркеры исходной дифференцировки (RPE65, CRALBP) и экспрессировали маркеры, отвечающие за адгезию, клеточную миграцию и тканевую контракцию (FN, коллаген I типа, N-кадгерин, α-SMA), а также маркеры плюрипотентных клеток (Рах6), что свидетельствует о дедифференцировке клеток в культуре. Кроме того, культивированные клетки ретинального пигментного эпителия экспрессировали маркеры ИСК (нестина, β-тубулина-III и др.), свидетельствующее о проявлении ими пронейральных свойств. Результаты ПЦР подтвердили данные ИЦХ: клетки ретинального пигментного эпителия экспрессировали нейральные маркеры β-tubulin-III и Musashi 1) и маркеры «стволовости» (Nanog, Oct4 и Рах-6). Причем уровень экспрессии гена Nanog был выше в сфероподобных структурах, чем в прикрепленных клетках. Признаки дедифференцировки были ярче выражены в клеточных культурах медленнее выходящих в монослой при первичной посадке, т.е. в клетках с фибробластоподобной и смешанной морфологией. Эти признаки сохранялись на ранних пассажах и исчезали по мере пассирования.

Выводы.

В клетках ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека in vitro происходят фенотипические и молекулярно-генетические изменения. Фенотип клеток ретинального пигментного эпителия in vitro определяется вначале плотностью посадки, затем клетки ретинального пигментного эпителия in vitro претерпевают дедифференцировку, происходящую в присутствии сыворотки в среде культивирования. Дедифференцировка - это промежуточное состояние клеток ретинального пигментного эпителия, индуцированное условиями in vitro. Направленная индукция in vitro приводит зрелые клетки ретинального пигментного эпителия взрослого человека к экспрессии маркеров плюрипотентности, пролиферации, миграции, изменению фенотипа и, наконец, к проявлению клетками пронейральных свойств.

Работа поддержана грантами РФФИ № 08-04-00081 и 08-04-00462.


Кузнецова А.В., Милюшина Л.A., Микаелян А.С., Александрова М.А.
Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва