Биомиметические пористые каркасы с высокой эластичностью, сделанные из минерализированного коллагена

Биомиметические пористые каркасы с высокой эластичностью, сделанные из минерализированного коллагена – иследование на животных

Atsuro Yokoyama, Michael Gelinsky, Takao Kawasaki, Takao Kohgo, Ulla Ko. nig, Wolfgang Pompe, Fumio Watari
Graduate School of Dental Medicine, Hokkaido University, Kita 13, Nishi 7, Kita-Ku, Sapporo 060-8586, Japan
Max Bergmann Center of Biomaterials, Technical University Dresden, Institute of Materials Science, Budapester Strasse 27, D-01069 Dresden, Germany

Received 10 November 2004; revised 11 February 2005; accepted 28 February 2005
Published online 25 July 2005 in Wiley InterScience (http://www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jbm.b.30331

Аннотация: гистологические исследования нового гидроксиапатита – коллагенового композиционного материала – проводились для того, чтобы оценить его возможное применение в качестве костнозамещающего материала. Трехмерные каркасы из биомиметически минерализованного коллагена показали связанную пористую структуру и эластичные механические свойства. Они были имплантированы в подкожную ткань и дефекты кости, сделанные в бедренной кости крыс, и забор образцов вместе с окружающими тканями был проведен через 1, 2, 4, 8 и 12 недель после операции. Вокруг материалов, имплантированных в подкожную ткань, наблюдалась незначительная воспалительная реакция, они были покрыты грубоволокнистой соединительной тканью и на поверхности этих каркасов отмечалось большое количество инородных гигантских клеток. Большая часть материалов, имплантированных в подкожную ткань, была резорбирована фагоцитами через 8 недель. В дефектах кости на поверхности материала через 1 неделю было выявлено новообразование костной ткани. Количество новой кости увеличивалось со временем и через 2 недели на поверхности материала появлялись остеокласты. Резорбция имплантированного в бедро материала и его замещение новой костью наблюдались через 12 недель во многих зонах имплантата. Эти процессы протекали быстрее, чем при применении других гидроксиапатит-коллагеновых материалов. Полученные результаты говорят о пригодности минерализованных коллагеновых каркасов в качестве имплантируемого материала в костно-тканевой реконструкции.

Ключевые слова: биомиметический; кость; коллаген; гидроксиапатит; смешанные/твердые ткани

ВВЕДЕНИЕ
 
В качестве костнозамещающего материала используется множество различных синтетических материалов. Каждый из них имеет свои преимущества, но также и недостатки, например, продукты деградации кислот у таких полимеров как полилактид или медленный биологический распад у гидроксиапатитовой керамики. Поэтому, для многих клинических целей аутогенный костный трансплантат является золотым стандартом, благодаря его хорошей и быстрой интеграции в окружающие ткани, быстрому ремоделированию в новую кость и небольшому количеству иммунологических проблем. Но получение аутогенных костей, таких как гребень повздошной кости, предполагает вторую операцию со всеми ее рисками, болью пациента и сложностью в получении достаточного количества костной ткани. В качестве альтернативы использованию аутотрансплантатов многие исследователи пытались и пытаются в настоящее время разработать такой синтетический материал, который повторял бы состав и структуру внеклеточного костного матрикса, состоящего главным образом из волокон коллагена I типа, минерализованных нанокристаллами гидроксиапатита (HAP). В самом начале разрабатывались простые смеси коллагена и гранул HAP, чтобы улучшить технологические свойства кальциево-фосфатных частиц во время операции 3. Ранние попытки синтезировать настоящие смеси коллагена и НАР в качестве материалов для имплантации были предприняты Теном Хайзеном с соавторами, но материал, о котором они говорили в 1995, являлся скорее кальциево-фосфатным костным цементом с включенными в его состав коллагеновыми волокнами, чем костноподобным нанокомпозитом.

В течение следующих лет многие другие группы публиковали свои сведения о более или менее биомиметических композитах коллагена и НАР и костнозамещающих материалах, производимых из них, но большинство из них применяли нефизиологические условия (температуру выше 38о С или устойчивый основной рН), которые могли привести к денатурации коллагенового компонента. Биомиметический метод был разработан для производства такого композита в условиях, близких к физиологическим (37о С и рН 7), где сборка фибрилл коллагена и кристаллизация наночастиц НАР происходят одновременно. Производство мембраноподобного материала, который обнаруживает поры только в пределах микрометров и, следовательно, может быть полезным для разделения тканей (лента из коллагена и НАР), уже начато, например, для направленной костной регенерации. Эта мембрана уже прошла испытания на животных моделях.

С помощью использования фибрилл биомиметически минерализированного коллагена типа 1 разработаны новые пористые, губчатые и объемные каркасы, которые могут использоваться для восстановления кости. Вдобавок, связанная пористость и размер пор около 200мк позволяют каркасам быть идеальными поддерживающими устройствами для инженерии твердых тканей. Материал химически связан с карбодиимидным производным дихлорэтана, что влечет за собой повышенную механическую жесткость в сравнении с коммерчески доступными коллагеновыми губками, а также он демонстрирует высокую степень эластичности во влажном состоянии, что допускает культивирование клеток под действием циклической механической нагрузки. Целью первого исследования на животных было выявить реакцию тканей на этот новый объемный материал и его способность к рассасыванию в подкожной и костной тканях крыс, чтобы оценить его возможную пользу в качестве костнозамещающего материала и в качестве альтернативы аутотрансплантатам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изготовление каркасов

Пористые каркасы были изготовлены из биомиметически минерализированного коллагена I типа14, согласно способу, разработанному в нашей лаборатории. Процедура была в деталях опубликована в предыдущем сообщении. Суммируя, можно сказать, что кислоторастворимый коллаген типа I (выделенный из бычьих сухожилий и любезно предоставленный компанией Innocoll (Saal/Donau, Германия) был растворен в 10 мM соляной кислоты и смешан с раствором хлористого кальция. рН был приведен к 7 добавлением ТРИС и фосфатного буфера, и смесь нагревалась до температуры 37оС в течении 12 часов. В этих условиях повторная сборка фибриллы коллагена и образование нанокристаллического НАР происходят одновременно. Реакция протекала при воздействии воздуха, так что был образован карбонизированный НАР. Продукт – однородно минерализированные фибриллы коллагена – был собран центрифугированием в виде воскообразного бесцветного вещества. Для приготовления пористых каркасов, использованных при данном исследовании, минерализированный коллаген был смешан с маточным раствором и размешивался до образования текучей суспензии, которой наполнили полости 48-луночного планшета и заморозили при 25оС. Образцы были подвергнуты лиофилизации и после связаны с 1% (% веса) раствором N-(3-диметиламинопропил)-N_-этилкарбодиимида (EDC) гидрохлорида в 80% (% объема) этанола в течение 1 час. Затем каркасы тщательно промывали в дистиллированной воде, в 1% растворе глицина, снова в воде и, наконец, лиофилизировали. Образцы для исследований на животных были простерилизованы гамма лучами. Для механического тестирования были созданы цилиндрические образцы с диаметром 13 мм и высотой 8 мм.

Растровая электронная микроскопия (РЭМ)

РЭМ была проведена с использованием аппарата Zeiss DSM 982 Gemini (Zeiss, Оберкохен, Германия). Рабочее расстояние было равно 4 мм [Рис.1 (с)] или 8 мм [Рис.1 (а, b)], ускоряющее напряжение было равно 4 кВ [Рис.1 (а)], 2 кВ [Рис.1 (b)] или 1 кВ [Рис.1 (с)], соответственно. Образцы были покрыты угольной пленкой.



Рисунок 1. Растрово-электронная микрофотография микроструктуры образцов: первичное увеличение в (а) 100_, (b) 5000_ и (с) 50000_ (сечение цилиндрического образца). Нанокристаллы гидроксиапатита (стрелки) наблюдаются на фибриллах коллагена.

Механические испытания

Эксперименты с циклическими нагрузками проводились с использованием электромеханической испытательной установки Instron 5566 (Instron Wolpert GmbH, Дармштадт, Германия). Используемые цилиндрические образцы имели диаметр 13 мм и высоту 8 мм. Они были сжаты при скорости 0.3 mm_1 50 раз до половины своей первоначальной высоты после 24-часового разбухания в дистиллированной воде.

Опыты на животных
 
Пятнадцать самцов крысы линии Вистар в возрасте 12 недель были задействованы в этом эксперименте. Крысам была сделана общая анестезия с помощью инъекции нембутала (этанинал натрия, 50 мг/кг веса тела). В области груди были сделаны подкожные каналы, а в левой бедренной кости были сделаны повреждения (2-3 мм). Цилиндрические образцы с диаметром 10 мм и высотой 8 мм были смочены в физиологическом растворе и разделены на четыре части. Каждая четверть была имплантирована в подкожную ткань и в костные повреждения. Опыты на животных были проведены в соответствии с Руководством по обращению и использованию лабораторных животных, Хоккайдо, Академия стоматологической медицины. Во время данных исследований не погибла ни одна крыса.

Гистологический анализ
 
Крысы были подвергнуты гистологическому анализу через 1, 2, 4, 8, и 12 недель после операции (по три крысы на каждую точку). Материал извлекали вместе с окружающими тканями, фиксмровали 10% нейтральным буферным формальдегидом, декальцинировали этилен диаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и заключали в парафин. Пробы были окрашены гематоксилином и эозином (НЕ) и азан-Маллори (AZ). Также устойчивая к тартрату кислая фосфатаза, маркер для остеокласта, была исследована с помощью ферментной гистохимии. Некоторые из имплантированных в подкожную ткань материалов были оставлены без декальцификации, помещены в парафин и окрашены НЕ и von Kossa (VK). Пробы были исследованы на такие реакции тканей как воспаление, остеогенез вокруг образцов и резорбцию материала.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение характеристик материала

Одновременная сборка фибрилл коллагена и кристаллизация НАР, разработанная в нашей лаборатории, ведет к образованию однородного композитного материала, который был полностью описан ранее. Ввиду условий, близких к физиологическим, продукт состоит из неизмененных фибрилл коллагена и нанокристаллов НАР. Применяя процесс вакуумной фильтрации, можно получить мембраноподобный материал (ленту). Если осадок был перерастворен, а суспензия затем лиофилизирована, можно получить пористые объемные каркасы любой формы и размера. Температура и скорость застывания влияют на размер пор – застывание при ­25оС дает связанные поры с диаметром 100–200 _м, достаточным для искусственного выращивания клеток. На Рис. 1 (а – с) показана микроструктура такого губкообразного каркаса в порядке возрастания:

Открытая структура пор разреза цилиндрического образца видна на Рис. 1 (а), близкая связь нанокристаллов НАР с волокнами коллагена показана на Рис. 1 (b), а схему собственного изгиба восстановленных фибрилл коллагена можно увидеть на Рис. 1 (с). Помимо этого, тесное минерально-белковое взаимодействие составных веществ демонстрируется при помощи трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ). Связывание с водорастворимым EDC стабилизирует материал, как показано Маккегни с соавторами на примере нативной коллагеновой губки и Ли с соавторами на примере коллаген- гликозаминогликановых каркасов. Пористая структура остается открытой, пока каркасы смочены водой, физиологическим раствором или кровью. EDC предпочитают из-за его низкой цитотоксичности в сравнении с глутаральдегидом. К тому же, во влажном состоянии материал обладает высокой эластичностью, как показано на Рис. 2 (а). В данном эксперименте с циклическими нагрузками цилиндрические образцы с диаметром 13 мм и высотой 8 мм подверглись сжатию 50 раз до половины своей первоначальной высоты (одноосевая нагрузка) после набухания в дистиллированной воде в течение 24 часов. После первых 4-5 циклов максимальная нагрузка (около 28 килопаскалей) не уменьшалась в течение всего эксперимента, и высота каркасов всегда возвращалась к своему первоначальному значению [Рис. 2 (b)]. Отрицательная нагрузка после отмены напряжения может иметь место из-за адгезивных сил между влажным образцом и поверхностью металлической плиты испытательной установки.

Гистологическое исследование

Реакция мягких тканей.

Имплантированные каркасы были покрыты грануляционной тканью с небольшими воспалительными изменениями через 1 неделю после операции. В порах наблюдалось множество клеток с крупными цитоплазматическими фибробластами, фибробластами с веретеновидной цитоплазмой и капиллярами, а на поверхности образцов в периферической области материала наблюдалось некоторое количество инородных гигантских клеток [Рис. 3 (а)]. Главным образом инородные гигантские клетки наблюдались в той части, где VK-маркер показывал кальциевый налет на материале в периферической области. С другой стороны, в центральной части массы наблюдались фибринная сетка и некоторое количество эритроцитов [Рис. 3 (а – с)]. Количество инородных гигантских клеток на материале росло, и соединительная ткань разрослась в центральную область через 2 недели. Через 4 недели материал был покрыт грубоволокнистой соединительной тканью. Маркированные базофильные слои, которые показывали кальциевый налет, наблюдались на поверхности материала. Многие инородные гигантские клетки были присоединены к базофильному слою, как показано на Рис. 4. Количество инородных гигантоцитов увеличивалось далее через 8 недель, и материал стал тонким и маленьким [Рис. 5 (а, b)]. Некоторое количество фибробластов наблюдалось в щелях и пустотах уменьшающегося материала [Рис. 5 (b)]. Через 12 недель в подкожной ткани материала не наблюдалось.

Реакция твердых тканей.

Масса материала была покрыта грануляционной тканью через 1 неделю после операции. В периферической части массы наблюдалось множество клеток с крупными цитоплазматическими фибробластов, фибробластов с веретеновидной цитоплазмой и капиллярами [Рис. 6 (а)]. На поверхности материала можно было заметить кубовидный остеобластоцит и формирование новой кости [Рис. 6 (b)]. Новая кость напрямую присоединялась к материалу [Рис. 6 (b)]. С другой стороны, в центральной части пористых образцов были видны фибринные сетки и тонкая грубоволокнистая соединительная ткань [Рис. 6 (а)]. Через 2 недели грануляционная ткань разрослась в центральную часть массы, и количество новообразованной кости вокруг материала выросло, как показано на Рис. 7.



Рисунок 2. Механические испытания: (а) фотографии влажного образца перед сжатием (сверху), в сжатом состоянии (посередине) и после отмены напряжения (снизу). (b) Диаграмма деформации влажного цилиндрического образца (диаметр 13 мм, высота 8 мм) до половины его первоначальной высоты при 50-кратной циклической нагрузке (одноосевая нагрузка) (график).



Рисунок 3. (а) Гистология через 1 неделю после имплантации в подкожную ткань. В порах периферической области массы материала находится грануляционная ткань с большим количеством фибробластов и капилляров (показаны звездочкой*). На поверхности материала наблюдались инородные гигантоциты (показаны стрелками). В центральной части были фибринные сетки и эритроциты (стрелки). Маркер НЕ. (b) Перед имплантацией материалы (звездочки) были окрашены в коричневый цвет VK-маркером. (с) Гистология через 1 неделю после имплантации в подкожную ткань. Материалы (белые звездочки) были прочно окрашены в темно-коричневый цвет маркером VK в сравнении с (b). На материалах наблюдались инородные гигантоциты (стрелки). Маркер VK.

Некоторые части образцов были покрыты новой костной тканью. Базофильный слой наблюдался в наружном слое материала, а также в имплантации в подкожный слой. Близко к базофильному слою находилась новая костная ткань (Рис. 7). Через 4 недели наблюдались костная ткань пластинчатой структуры и костномозговая ткань, которые указывали на реконструкцию новообразованной кости, как показано на Рис. 8 (а). TRAP-положительные клетки наблюдались не только на новой кости, но также и на материале, показанном на Рис. 8(b). Соединения новой кости и материала уменьшились через 8 недель после операции. Особенно уменьшился размер материала, и увеличились пропорции новой костной ткани. Многие части каркасов были покрыты новой костной тканью пластинчатой структуры, как показано на Рис. 9(а). TRAP-положительные клетки наблюдались на материале, их количество уменьшалось, как показано на Рис. 9(b). Близко к границе между материалом и новой костью в пустотах новообразованной кости наблюдалось большое количество остеоцитов, как показано на Рис. 9(с). Через 12 недель после операции большая часть материала была замещена костной тканью или абсорбирована. Некоторые части образцов остались в прежнем состоянии, но покрылись новой костью (Рис. 10).

ОБСУЖДЕНИЕ
 
В этом исследовании использовались недавно разработанные объемные каркасы, изготовленные из биомиметически минерализованного коллагена со связанной пористой структурой и эластичными механическими свойствами. Эти характеристики считаются преимуществом, учитывая врастание клеток, биоабсорбционную способность (благодаря большой площади поверхности) и простоте обращения для хирурга, потому что губкообразный эластичный материал легко можно поместить в повреждения кости, такие как углубление после удаления зуба, и он обеспечивает лучшее взаимодействие между имплантируемым материалом и тканями, чем плотные материалы. Однако, при реакции мягких тканей на новый имплантируемый материал наблюдалась грануляционная ткань с фибробластами и распространенными капиллярами.



Рисунок 4. Гистология через 4 недели после имплантации в подкожную ткань. Большое количество инородных гигантоцитов (стрелки) присоединено к базофильному слою (стрелки) материала (звездочка). Маркер НЕ.



Рисунок 5. (а) Гистология через 8 недель после имплантации в подкожную ткань. Форма и размеры материалов (звездочки) начали утончаться и уменьшаться. Маркер НЕ. (b) Гистология через 8 недель после имплантации в подкожную ткань. Инородные гигантоциты (стрелки) можно наблюдать на материале (звездочка). В щелях и пустотах (стрелки) материала (звездочка) наблюдается некоторое количество фибропластов. Маркер НЕ.

Выраженные воспалительные изменения, такие как некроз, деградация или инфильтрация, в окружающих тканях не были обнаружены. Эти результаты показали, что материал имеет хорошую биосовместимость. По данным Doi с соавторами, их смеси коллаген–НАР пластинчатой формы и пористой структуры были абсорбированы через 4 недели TRAP-положительными клетками в спинной мускулатуре крыс. Материал коллаген–НАР объемного вида и пористой структуры, разработанный Itoh с соавторами, оставался 24 недели в мягких тканях крыс, и наблюдался фагоцитоз частиц материала макрофагами. В данном исследовании фагоциты, такие как макрофаги и инородные гигантоциты, наблюдались на поверхности композитов через 1 неделю, а щели и пустоты возникли через 8 недель. Следовательно, большая часть материала должна быть абсорбирована через 8 недель после имплантации в мягких тканях с помощью фагоцитоза. Разница в скорости резорбции в мягких тканях может влиять на следующие факторы: денатурирование и связывание коллагена, микроструктуру и форму образцов. Так как минерализированные коллагеновые каркасы были изготовлены в условиях, близких к физиологическим (37°C и рН 7), фибриллы коллагена не были денатурированы, в отличие от коллаген–НАР композитных материалов, описанных другими группами, которые применяли нефизиологические условия (температура выше 38°C или устойчивый основной рН), что могло привести к деформации коллагенового компонента. 



Рисунок 6. (а) Гистология через 1 неделю после имплантации в костный мозг. Грануляционные ткани с фибропластами и новой костью (стрелки) наблюдались в порах периферической области массы материалов (звездочки). Фибринная сетка и эритроциты (белые стрелки) наблюдались в центральной части. Маркер НЕ. (b) Гистология через 1 неделю после имплантации в костный мозг. Новая кость (белая звездочка) напрямую присоединилась к материалу (звездочка). Кубовидные остеобласты (стрелки) наблюдаются на поверхности новой кости. Маркен НЕ.



Рисунок 7. Гистология через 2 недели после имплантации в костный мозг. Некоторые из материалов (звездочки) покрыты новой костью (белые звездочки). Базофильный слой наблюдается в наружном слое материалов. Маркер НЕ.

Следовательно, разложение нашего биомиметического материала должно происходить быстрее, чем других коллаген–НАР композитов. Однако, инородные гигантоциты наблюдались в области кальциевых отложений, но TRAP-положительные клетки не были замечены в мягких тканях после имплантации, в отличие от описания Doi с соавторами. Кальций в крови при операции и в биологических жидкостях мог отложиться в виде фосфата кальция на фибриллах коллагена из-за своей структуры, близкой к структуре натуральной кости. Это следует отнести к клеточно-обусловленной абсорбции. В будущем необходимы дальнейшие исследования, такие как изучение с помощью ТЕМ.

В костном мозге через 1 неделю активный остеогенез происходил прямо на поверхности каркасов без участия грубоволокнистой соединительной ткани, и новая кость со временем росла, окружая материал. Это указывает на то, что материал имеет отличную остеосовместимость и остеокондуктивность. Отложение фосфата кальция в крови на наружный слой материала вблизи от новой кости следует отнести к характерной структуре этого материала, схожей со структурой натуральной кости. 



Рисунок 8. (а) Гистология через 4 недели после имплантации в костный мозг. Костный мозг виден вокруг новой кости (белые звездочки) и материалов (звездочки). В новой кости наблюдаются пластинчатые структуры. Маркер НЕ. (b) Гистология через 4 недели после имплантации в костный мозг. TRAP-положительные гигантоциты (стрелки) наблюдаются на поверхности новой кости (белые звездочки) и материалов (звездочки). Маркер TRAP.



Рисунок 9. (а) Гистология через 8 недель после имплантации в костный мозг. Материалы (звездочки) уменьшились и покрыты новой костью (белые звездочки) с пластинчатой структурой. Маркер AZ. (b) Гистология через 8 недель после имплантации в костный мозг. Количество TRAP-положительных клеток (стрелки) на материале (звездочки) и на новой кости (белые звездочки) уменьшилось. Маркер TRAP. (с) Гистология через 8 недель после имплантации в костный мозг. Близко к границе между материалом (звездочки) и новой костью в новой кости (белые звездочки) наблюдалось большое количество остеоцитов (стрелки). Маркер AZ.

Отложение кальция является, судя по всему, преимуществом для формирования кости на поверхности имплантируемых материалов. Следовательно, на материалах протекал активный остеогенез. TRAP-положительные многоядерные гигантоциты на поверхности материала указывают на то, что пористый каркас, изготовленный из биомиметически минерализованных фибрилл коллагена, был ресорбирован остеокластами, подобно натуральной кости. Похожие исследования описывает Kikuchi с соавторами,  Itoh с соавторами и Du с соавторами относительно собственных композитов коллаген–НАР. Хотя порошковая керамика НАР с трудом резорбируется в естественных условиях, нанокристаллический и синтезированный с помощью жидкостной химический обработки НАР может разлагаться остеокластами. Itoh с соавторами, предположили процесс самоорганизации на имплантате коллаген–НАР, что означает, что композит был разложен коллагеназой и остеокластами. Такие клетки притягиваются остеобластами и заставляют их производить новый минерализованный матрикс. Скорость разложения коллаген–НАР материалов в кости должна быть такой же, как в подкожной ткани: Du с соавторами, Kikuchi с соавторами и Itoh с соавторами,  пишут, что большая доля их плотных образцов осталась в прежнем состоянии через 12 недель. Многие части настоящих композитов были резорбированы и замещены костной тканью через 12 недель после операции. Мембраноподобный материал (лента) с плотной структурой, изготовленный из тех же биомиметически минерализованных фибрилл коллагена, использовался для развития пористых каркасов и употреблялся в данном исследовании, оставаясь на 26 недель в черепе крысы.

Одним из возможных объяснений различия в скорости разложения может быть пористость материала в сочетании с составными частями процесса и размеров материалов и повреждений кости. Высокая степень пористости, судя по всему, ускоряет резорбцию благодаря более быстрому врастанию клеток в объем материала. Еще одно интересное свойство материала – способ замещения новой костной тканью, схожий с аутогенными костными трансплантатами. Как известно, формирование новой кости и резорбция частиц трансплантированного материала протекает на поверхности имплантатов на ранней стадии с помощью остеобластов и остеокластов соотверственно, и костный трансплантат покрывается новообразованной костной тканью. Наконец, аутогенный костный трансплантат полностью или частично замещается новой костью, особенно при использовании кортикальной кости. Однако, некоторые части композитов коллаген–НАР были резорбированы остеокластами, а другие части были напрямую покрыты новообразованной костью. На границе между композитами и новой костью не было замечено остеокластов. Эти открытия схожи с открытиями в области аутогенных кортикальных трансплантатов. Интересно, что много остеоцитов в пустотах новообразованной кости находилось вблизи границы между композитами и новой костью. Fujita с соавторами пишет, что некоторое количество отростков остеоцитов наблюдалось вокруг - трикальцийфосфата в кости, и высказывает предположение, что остеоциты могут относиться к реконструкции - трикальцийфосфата кости. Du с соавторами также описывают остеоциты вблизи от их коллаген–НАР композитов. В последнее время высказывались разные теории относительно функций остеоцитов; остеоциты могут участвовать в обновлении костной ткани, а их сеть участвовать в ионном обмене. В течение данного исследования наблюдалось множество остеоцитов вблизи от границы между новой костью и материалом, следовательно, остеоциты скорее всего относятся резорбции и обновлению костной ткани. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения отношений между остеоцитами и резорбцией нового композитного материала.
 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Недавно разработанный материал для реконструкции твердых тканей был испытан на крысах путем имплантации образцов под кожу и в бедренную кость. Пористые и объемные каркасы состояли из биомиметически минерализированного колагена I типа, который имитирует внеклеточный матрикс костной ткани.



Рисунок 10. Гистология через 12 недель после имплантации в костный мозг. Оставшиеся материалы (звездочка) были покрыты новой костью (белые звездочки). Маркер НЕ.

Этот материал показал хорошую биологическую совместимость, а резорбция и реконструкция оказались очень схожими с аутогенным костным трансплантатом при пересадке в бедренную кость. Быстрый процесс разложения может объясняться наноскопическими размерами, а следовательно, квазиаморфным состоянием кристаллов НАР, зарождающихся в коллагеновом матриксе. Резорбция новых каркасов протекала быстрее, чем это описано с другими материалами, сделанными из коллаген–гидроксиапатитовых композитов. Благодаря своим эластичным свойствам новые каркасы оказались легки в обращении, и их легко приспособить к геометрии повреждений. Они могут использоваться как альтернатива аутогенным костным трансплантатам для реконструкции твердых тканей.

Авторы благодарят Y. Imai, S. Yamamoto и T. Obata за помощь в проведении опытов на животных и маркировании препаратов и благодарны Mrs. O. Zieschang за ее помощь в подготовке и Dr. Z. Ruszczak и R. Mehrl (Innocoll, Saal, Германия) за предоставление коллагена, использованного для получения материала. Мы также глубоко признательны Dr. A. Sewing and Timothy Douglas за полезные дискуссии.

 
ЛИТЕРАТУРА.

1. Li S, McCarthy S. Further investigations on the hydrolytic degradation of poly (DL-lactide). Biomaterials 1999;20:35– 44.
2. Hooggendoorn HA, Renooji W, Akkermanss LMA. Long-term study of large ceramic implants (porous hydroxyapatite) in dog femora. Clin Orthop 1984;187:281–288.
3. Harvey WK, Pincock JL, Matukas VJ, Lemons JE. Evaluation of a subcutaneously implanted hydroxylapatite-avitene mixture in rabbits. J Oral Maxillofac Surg 1985;43:277–280.
4. TenHuisen KS, Martin RI, Klimkiewicz M, Brown PW. Formation and properties of a synthetic bone composite: hydroxyapatite–collagen. J Biomed Mater Res 1995;29:803– 810.
5. Boskey AL. Hydroxyapatite formation in a dynamic collagen gel system: effects of type I collagen, lipids, and proteoglycans. J Phys Chem 1989;93:1628 –1633.
6. Wang RZ, Cui FZ, Lu HB, Wen HB, Ma CL, Li HD. Synthesis of nanophase hydroxyapatite/collagen composite. J Mater Sci Lett 1995;14:490–492.
7. Lawson AC, Czernuszka JT, Collagen– calcium phosphate composites. Proc Inst Mech Eng H 1998;212:413– 425.
8. Du C, Cui FZ, Zhu XD, de Groot K. Three-dimensional nano-HAp/collagen matrix loading with osteogenic cells in organ culture. J Biomed Mater Res 1999;44:407– 415.
9. Kikuchi M, Itoh S, Ichinose S, Shinomiya K, Tanaka J. Selforganization mechanism in a bone-like hydroxyapatite/collagen nanocomposite synthesized in vitro and its biological reaction in vivo. Biomaterials 2001;22:1705–1711.
10. Itoh S, Kikuchi M, Takakuda K, Koyama Y, Matsumoto HN, Ichinose S, Tanaka J, Kawauchi T, Shinomiya K. The biocompatibility and osteoconductive activity of a novel hydroxyapatite/collagen composite biomaterial, and its function as a carrier of rhBMP-2. J Biomed Mater Res 2001;54:445– 453.
11. Itoh S, Kikuchi M, Koyama Y, Takakuda K, Shinomiya K, Tanaka J. Development of an artificial vertebral body using a novel biomaterial, hydroxyapatite/collagen composite. Biomaterials 2002;23:3919 –3926.
12. Tampieri A, Celotti G, Landi E, Sandri M, Roveri N, Falini G. Biologically inspired synthesis of bone-like composite: Self-assembled collagen fibers/hydroxyapatite nanocrystals. J Biomed Mater Res 2003;67A:618–625.
13. Kikuchi M, Matsumoto HN, Yamada T, Koyama Y, Takakuda K, Tanaka J. Glutaraldehyde cross-linked hydroxyapatite/collagen self-organized nanocomposites. Biomaterials 2004;25:63–69.
14. Bradt JH, Mertig M, Teresiak A, Pompe W. Biomimetic mineralization of collagen by combined fibril assembly and calcium phosphate formation. Chem Mater 1999;11:2694 –2701.
15. Weis K, Pompe W, Bradt J. Method for the synchronous collagen fibril assembly and mineralization and its use as an implant material. Patent Nos. EP0945146, 1999 and U. S. 6384196; 2002.
16. Burth R, Gelinsky M, Pompe W. Collagen-hydroxyapatite tapes—a new implant material. Tech Textile 1999;8:20 –21.
17. Schliephake H, Tavassol T, Gelinsky M, Dard M, Sewing A, Pompe W. Use of a mineralized collagen membrane to enhance repair of calvarial defects in rats. Clin Oral Implant Res 2004; 15:112–118.
18. Gelinsky M, Ko.nig U, Sewing A, Pompe W. Porous scaffolds made from mineralised collagen—a biomimetic bone graft material. Mat-wiss Werkstofftech 2004;35:229–233 [in German].
19. Burmeister B, Domaschke H, Gelinsky M, Ro.sen-Wolff A, Hanke T, Pompe W. Co-culture of osteoblasts and osteoclasts on resorbable mineralised collagen scaffolds: establishment of an in vitro model of bone remodeling. Eur Cell Mater 2003; 5(Suppl. 2):18 –19.
20. McKegney M, Taggart I, Grant MH. The influence of crosslinking agents and diamines on the pore size, morphology and the biological stability of collagen sponges and their effect on cell penetration through the sponge matrix. J Mater Sci Mater Med 2001;12:833– 844.
21. Lee CR, Grodzinsky AJ, Spector M. The effects of cross-linking of collagen-glycosaminoglycan scaffolds on compressive stiffness, chondrocyte-mediated contraction, proliferation and biosynthesis. Biomaterials 2001;22:3145–3154.
22. Wissink MJ, van Luyn MJ, Beernink R, Dijk F, Poot AA, Engbers GH, Beugeling T, van Aken WG, Feijen J. Endothelial cell seeding on crosslinked collagen: effects of crosslinking on endothelial cell proliferation and functional parameters. Thromb Haemost 2000;84:325–331.
23. Hafemann B, Ghofrani K, Gattner HG, Stieve H, Pallua N. Crosslinking by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) of a collagen/elastin membrane meant to be used as a dermal substitute: effects on physical, biochemical and biological features in vitro. J Mater Sci Mater Med 2001;12:437–446.
24. Du C, Cui F Z, Feng QL, Zhu XD, de Groot K. Tissue response to nano-hydroxyapatite/collagen composite implants in marrow cavity. J Biomed Mater Res 1998;42:540 –548.
25. Doi Y, Horiguchi T, Moriwaki Y, Kitago T, Kajimoto T, Iwayama Y. Formation of apatite– collagen complexes. J Biomed Mater Res 1996;31:43– 49.
26. Yokoyama A, Matsuno H, Yamamoto S, Kawasaki T, Kohgo T, Uo M, Watari F, Nakasu M. Tissue response to a newly developed calcium phosphate cement containing succinic acid and carboxymethyl-chitin. J Biomed Mater Res 2003;64A:491–501.
27. Ham AW, Harris WR. Repair and transplantation of bone. In: Bourne GH editor. The biochemistry and physiology of bone (2nd ed., Vol 3). New York: Academic Press; 1971. p. 337–339.
28. Takahashi H. Ishokukotsunobyoutaiseiri. In: Suda T, Ozawa H, Takahashi H, editors. Kotsunokagaku. Tokyo: Ishiyaku-Shuppan; 1990. p 222–230 [in Japanese].
29. Fujita R, Yokoyama A, Nodasaka Y, Kohgo T, Kawasaki T. Ultrastructure of ceramic–bone interface using hydroxyapatite and beta-tricalcium phosphate ceramics and replacement mechanism of beta-tricalcium phosphate in bone. Tissue & Cell 2003;35:427– 440.
30. Aarden EM, Burger EH, Nijweide PJ. Function of osteocytes in bone. J Cell Biochem 1994;55:287–299.
31. Burger EH, Klein-Nulend J, van der Plas A, Nijweide PJ. Function of osteocytes in bone their role in mechanotransduction. J Nutr 1995;125:2020 –2023


Перевод Борисовой Марины