Адсорбция протеинов и биомолекул к поверхности материалов

Современные имплантаты для искусственной замены структуры и функции ткани или органа состоят из биомеханически ориентированных объемных материалов и покрытий, устойчивых к действию биологических жидкостей. Как правило, толщина покрытия на металле лежит в диапазоне 3 до 200 мкм. Материал поверхностного слоя может быть химически инертным, например из TiO₂, и иметь только незначительную силу притяжения для биологических макромолекул. Нанесением определенных типов покрытий на конкретный материал можно уменьшить свободную энтальпию адсорбции для биомакромолекул в соответствии с формулой:

G = H - TS,

где Н - энтальпия, S - энтропия, Т - температура.

При помещении материала в биологическую жидкость на нем из водных растворов адсорбируются ионы водорода (Н⁺) или гидроксила (НО^-). Адсорбция ионов ОН^- создает на поверхности отрицательный заряд, адсорбция ионов Н⁺ - положительный, т.к. количество ионов соответствующего типа зависит от величины рН раствора. Для каждого материала существует специфическая величина рН, при которой концентрация ионов ОН^- соответствует концентрации ионов Н⁺. Эта величина называется точкой нулевого заряда (ТН3). Например, для поверхности TiO₂ величина рН _тн3 = 6,2; а для оксида алюминия (оксидная керамика, часто используемая в суставных имплантатах) рН _тн3 = 2,3. Во внутриклеточной жидкости возможен обмен ионами, в частности ионами Сl^- и Na⁺ (Клаус, Павличек, 1985).

Поверхностный заряд достигает равновесия во внеклеточной жидкости путем образования равного по величине, но противоположного по знаку заряда в приповерхностном слое, образуя двойной электрический слой. Для его физического описания используется модель плоского конденсатора Гельмгольца (линейное падение потенциала в приповерхностном электролите) или модель ионной атмосферы Gouy-Chapman (экспоненциальный ход потенциала). Модель Гельмгольца переоценивает стабильность локальной структуры, связанной на поверхности, модель Gouy-Chapman его недооценивает. Компромиссом является модель Штерна, по которой вблизи поверхности потенциал изменяется почти линейно (Гельмгольц), а потом почти экспоненциально (Gouy-Chapman). При адсорбции ионов из электролита тканевой жидкости на биоматериалах могут возникнуть такие состояния поверхности, которые изменяют электронную структуру поверхности имплантата (Клаус, Павличек, 1985). Еще более сильное воздействие оказывается на нестехиометрические соединения, которые встречаются при репассивировании механически поврежденных поверхностных оксидах при градиенте аэрации и недостаточной подаче электролита, например в щелях на поверхности ортопедических имплантатов (Thull, 1992).

При имплантации биоматериалов в кость они вступают в сложное взаимодействие с биологическими жидкостями и тканями. Одной из первых реакций является адсорбция протеинов из плазмы крови и тканевой жидкости. При этом следует учесть, что существуют два основных вида адсорбции - физическая (нековалентные силы сцепления Ван-дер-Ваальса) и химическая или хемосорбция (ионные, водородные, гидрофобные взаимодействия). Хемосорбция, за счет образования сильных химических и электростатических связей, играет ведущую роль в процессах адсорбции и конформации протеинов. Нековалентные относительно слабые взаимодействия Ван-дер-Ваальса подразделяются, в свою очередь, на силы Креезома (постоянно-постоянный диполь), Дебая (постоянно-индуцированный диполь) и Лондона (индуцированно-индуцированный диполь) и вместе с другими в большей степени влияют на третичную и четвертичную структуру протеинов. Следует заметить, что в пористых покрытиях существенную роль играют капиллярные силы. Жидкость всегда стремится понизить свое поверхностное натяжение, и адсорбция поверхностно-активных веществ способствует этому процессу.

Из термодинамических соображений Гиббс вывел уравнение адсорбции, характеризующее адсорбционное равновесие, устанавливающееся между молекулами растворенного вещества внутри раствора и поверхностью адсорбента:

G = c/RT • dγ/dc,

где G - количественная мера адсорбции, указывающая число молей растворенного вещества в поверхностном слое (поверхностная концентрация); с - молярная концентрация в растворе; γ - поверхностное натяжение. Если производная dγ/dc -отрицательная величина, то с увеличением концентрации поверхностное натяжение уменьшается и повышается адсорбция белков на поверхности.

При химической адсорбции, когда на поверхности адсорбента образуется мономолекулярный слой, пользуются изотермой Ленгмюра:

N_a= zωc / 1+ ωе,

где N_a - число молей вещества, адсорбированного на единице площади твердой фазы; z - максимальное число молей, приходящееся на единицу поверхности при ее полном насыщении или на единицу массы адсорбента; ω - коэффициент адсорбции; с - молярная концентрация вещества в растворе. (Карапетьянц, 1970; Волькштейн, 1978; Клаус, Павличек, 1985).

Разные биоматериалы отличаются между собой по характеру адсорбции биомолекул и клеток. Для имплантатов, применяемых в травматологии и ортопедии, необходимо, чтобы адгезивные белки - фибриноген, коллаген - адсорбировались на поверхности с последующей интеграцией с костной тканью и солями кальция. При создании клапанов сердца и сосудов требуется использовать биоматериалы, к которым вышеуказанные протеины вообще не прикреплялись бы и, следовательно, не приводили к образованию тромба (Шумаков, 1992; Барбараш и др., 1995; Thull, 1982).

Прочность и длительность адгезии определяется стабильностью комплексов, возникающих в результате взаимодействия биоматериалов с протеинами. Причем сильные взаимодействия в имплантатах можно предотвратить замедлением переноса носителя заряда на границе раздела посредством адекватного выбора материала, введением в него добавок или нанесением специального покрытия (Барбараш и др., 1995). Например, предварительная обработка материала альбумином способствует образованию неактивного поверхностного слоя, тормозящего адсорбцию любых протеинов (Thull, 1982).

Информационный обмен (коммуникация) между материалом и биологической тканью, клетками и внеклеточной матрицей происходит в основном через продукты разложения материала.

У электропроводящих материалов коммуникацию можно понимать как следствие перехода заряда через фазовую границу между поверхностью имплантата и, например, макромолекулами.

Влияние градиента потенциалов, т.е. электрического поля в приповерхностных электролитах, на биологические макромолекулы изучено недостаточно хорошо. Теоретически, электрические поля могут изменить третичную и четвертичную структуру протеинов разрыхлением слабых электростатических или водородно-мостиковых связей, т.к. энергия связи лежит между 12-29 кДж/моль (Поликар, 1976). Деформации расположения атомов или конформационные изменения могут быть настолько сильными, что иммунная система определяет эти протеины как чужеродные тела. При идентификации адсорбированного протеина следует учитывать все его возможные модифицированные формы.

Для некоторых металлов и материалов покрытий имеются результаты испытаний на них альбумина. Маркировка протеинов атомами С-14, излучающими бета-частицы позволяет измерить общую концентрацию адсорбированных молекул. Метод ELISA способствует идентификации протеинов с учетом уровня их конформации. Конформация белков, как правило, снижает способность антител взаимодействовать с измененным антигеном. При этом определение отношения между реагирующими и не реагирующими антителами с антигеном может являться мерой способности поверхности биоматериала, в данном случае альбумина, к конформации после его адсорбции. У биосовместимого материала биомолекулы на его поверхности при адсорбции подвергаются минимальной модификации. Для них отношение адсорбированных неизменившихся молекул к количеству всех адсорбированных молекул близко к 1. Если эта величина меньше 1, то биосовместимость материалов мала. Следует помнить, что иммуноферментный анализ учитывает конформацию только одной группы антигенов, которые могут не изменяться при конформационных превращениях. Например, если тестируемый белок имеет еще одну или несколько антигенных групп или приобретает новые антигенные свойства при своей модификации под действием тестируемого материала, то использование вышеуказанного метода в качестве показателя биосовместимости является не совсем корректным. Иммуноферментная техника в данном случае будет малоэффективна, т.к. в этих условиях она не способна выявить вышеуказанные изменения в биомолекулах.

Как уже было сказано выше, при помещении любого инородного материала в организм происходит чрезвычайно быстрая адсорбция белков плазмы на его поверхности. Механизмы этого процесса зависят как от свойств имплантата, так и окружающих его протеинов, электролитов, уровня рН, насыщения кислородом и ряда других факторов (Иманиси, 1988). При этом взаимодействие может происходить за счет электростатических, водородных, дисульфидных, ионных и других механизмов, с образованием нестойких или химически прочных связей (Дарбре, 1989). Протеины могут вступать в реакцию белкового обмена или десорбироваться, но в любом случае на поверхности имплантата неизбежно образуется белковый слой. По современным представлениям, эта пленка играет исключительную роль в процессах, связанных с адгезией клеток. В частности, это касается тромбоцитов, эритроцитов, лейкоцитов, остеобластов или остеокластов и микроорганизмов, от которых, в конечном случае, зависит качество работы имплантируемого устройства (Имаи, 1988).

Остановимся на некоторых принципиальных моментах этого процесса. Так, наиболее часто адсорбция белков плазмы или ростовых факторов исследуется путем помещения образца в сбалансированную солевую среду (фосфатный буфер Дульбекко с или без ионов кальция и магния, растворы: физиологический, Хэнкса, Эрла, Рингера) с тестируемым протеином в разведении от 1 до 3 мкг на 1 см² поверхности. Совместную инкубацию проводят в течение 1-4 часов при температуре 37 °С, при которой обычно устанавливается динамическое равновесие. Затем образцы промывают в водном растворе со скоростью жидкости 10 мл/с в течение 1-2 минут для удаления непрореагировавших молекул и проводят химический и электронно-микроскопический анализ. Обычно используют белки, меченные ¹²⁵I, ³Н-тимидином или другими изотопами, которые легко встраиваются в их структуру или продаются в виде чистых коммерческих препаратов. Это позволяет определить количество адсорбирующегося протеина. С помощью обычной и растровой электронной микроскопии удается определить толщину слоя пленки и ее архитектонику. Кроме этих приемов можно использовать радиоиммунные или иммуноферментные технологии, которые позволяют не только дать количественную характеристику, но и изучить взаимодействие двух или более числа белков. ИК- и УФ-спектроскопии, как и электрофоретическое разделение белков, сейчас используются реже в связи с их малой информативностью (Чард, 1978; Имаи, 1988; Дарбаре, 1989; Кэтти, 1991).

В таблице представлены ряд основных белков и содержание их в сыворотке крови или их биоактивная концентрация.

Молекулярная масса и содержание в крови и биологических жидкостях некоторых основных белков (по Е. Имаи, 1988, с некоторыми модификациями)

Считается, что адсорбция белков всегда в той или иной степени вызывает их модификацию. В качестве примера можно привести конформационные фрагменты фибронектина, свойства которых значительно отличаются друг от друга. Так, если пептиды с м.м. 433,4 Д обеспечивают связывание фибробластов, то при этом они ингибируют взаимодействие фибронектина с тромбоцитами, а пептиды с м.м. 403,4 Д этими свойствами не обладают (Гомазко, 1995). Фибронектин участвует в формировании сгустка крови при хирургической травме и адсорбируется на вводимых имплантатах. По-видимому, с его участием происходит связывание сосудистых клеток и тромбоцитов. Так, обработка полистирола in vitro фибронектином повышает адгезию к нему клеток эндотелия и тромбоцитов на 40-60%. Удаление из среды гепарина с помощью гепариназы увеличивало прилипание клеток на 10%. Напротив, добавление в среду гепарина (100 ЕД/мл) полностью подавляло адгезию эндотелия к пластику. Фибронектин, по сравнению с перлейканом, обладает более выраженной адгезивной способностью по отношению к тромбоцитам (Underwood et al., 1998). Адсорбированные на поверхности биоактивные протеины, очевидно, могут изменять функциональные свойства биоматериалов, в частности стекол и керамики. Механизм этого взаимодействия может быть самым разнообразным. В частности, по отношению к фибронектину, как одному из наиболее изученных протеинов, было установлено, что при добавлении его в телесную жидкость он адсорбируется на поверхности биостекла. При этом Фн не препятствует выходу Si из стекла и затрудняет образование кальциофосфатного слоя на границе стекла. Тем не менее, при этом замедляется кинетика образования КФ на границе раздела стекло-жидкость, а также изменяется соотношение Са/Р (Lu et al., 1998). Следовательно, качественный и количественный состав апатитного слоя, формирующегося вокруг стекла, под действием Фн подвергается существенной трансформации, что в конечном счете не может не повлиять на взаимодействие имплантируемого материала с костными клетками. Другие протеины, вероятно, тоже способны оказывать воздействие на этот процесс, а также включать аналогичные или иные механизмы, роль которых все еще остается малоизученной.

Ионы кальция и магния принимают участие в механизмах клеточной адгезии (Альберте и др., 1994). Вполне логично предположить, что если в КФ керамику ввести ионы магния, то это может усилить способность поверхности материала прикреплять к себе остеогенные клетки и, тем самым, способствовать процессу связывания костной ткани. Это было подтверждено в опытах на кроликах, которым в бедро имплантировали стержни из TiAlV сплава, покрытые ГА керамикой, нанесенной плазменным напылением. В материал посредством ионной имплантации дополнительно вносили ионы магния в дозе 1x10⁷/см². Оказалось, что через 3 недели, но не ранее, в опытной группе интеграция костной ткани с имплантатом достоверно превышала контрольные значения, что было доказано на ультратонких срезах с использованием флуоресцентных меток (тетрациклин, кальцеин синий, кальцеин зеленый, ализарин красный). Предполагается, что данный эффект обусловлен влиянием магния не только на адгезию костных клеток, но и функциональную активность остеобластов (Zhang et al., 1998).

Кроме Фн, имплантаты могут взаимодействовать с хемокинами, интерлейкинами, факторами и цитокинами, влияние некоторых из них на костную ткань представлено в таблице (Balkwill, 1995; Duran, Muegge, 1997).

Влияние ряда цитокинов, гормонов и биомолекул на костную ткань (по Willert, Buchhorn, 1999)

Интересно отметить тот факт, что адгезия белков во многом зависит от заряда поверхности биоматериала и его диэлектрических и электропроводящих свойств. Наличие отрицательного заряда на поверхности биоматериала, например стекла, полистирола, фибронектина, коллагена, поли-D-лизина и др., способствует прикреплению к ним клеточных мембран за счет электростатических сил. С другой стороны, отсутствие электронного обмена между металлом и тканью, как это ни парадоксально, может также обеспечивать высокую аттракционную способность остеобластов и других клеток, например, при использовании титановых материалов. Механизм этого эффекта, очевидно, опосредованный, через адгезию белков плазмы, к которым затем и прикрепляются клеточные элементы (Kovacs, Games, 1996; Kidanel et al, 1998).

Тестирование на способность материалов к адсорбции тех или иных веществ позволяет говорить о потенциале к проявлению тех или иных свойств.

Следует учитывать тот факт, что в системе in vitro концентрации исследуемых пептидов, как правило, во много раз превосходит их содержание в организме. В качестве иллюстрации можно привести результаты тестирования содержания ИЛ-1 или КСФ, которые в культуре ткани приводят к терминальной, часто необратимой пролиферации и дифференцировке клеток-предшественников миелопоэза, что в конечном счете опустошает их пул. В реальном организме концентрация ростовых факторов, цитокинов сохраняется на более низком уровне (Metcalf, 1989).

Кроме того, все они действуют в сложном ансамбле, взаимно дополняя и координируя не только общее взаимодействие, но и определяя пара- и аутокринную регуляцию друг друга. Так, при выращивании остеобластов дозу ИЛ-6 можно в 2-3 раза уменьшить, если в культуре будет присутствовать ИПФР-1 или КСФ (Nicola, 1995). Все это говорит о том, что определение адсорбционной способности к тем или иным ростовым и остеогенным факторам в системе in vitro является только ориентиром для дальнейшего более углубленного изучения биологических свойств тестируемых биоматериалов.

Теоретически возможно создание таких композитных материалов для нужд травматологии и ортопедии, которые работали бы в качестве разлагающих матричных носителей. Этот принцип давно уже стал применяться в фармацевтической промышленности, но пока не нашел своего развития в травматологии и ортопедии (Нагаи, Минабэ, 1988). Единственным исключением из этого правила являются биокерамические изделия на основе растворимой кальциофосфатной керамики и с коллагеновыми покрытиями (Миронов, 1999; Bruijn, 1993). Однако следует сразу заметить, что здесь изначально используются материалы, выделенные из кости, и, возможно, наряду с необходимыми кальциофосфатами и другими микроэлементами, в процессе технологии переносятся те структуры, которые отвечают за адгезию остеоиндуктивных молекул (Williams, Scott, 1996). Вероятно, поэтому синтетические аналоги ГА не обладают биоактивностью в необходимой степени (Kovacs, Games, 1996).

Техника изучения адгезии клеток (тромбоцитов, эритроцитов и лейкоцитов) и микробных тел детально отражена в работах Иманаси (1987), Фрешни (1989), Манка (1990). В связи с этим мы коснемся только главных, узловых моментов. Существуют два основных способа изучения этого свойства. Один из них является прямым, когда объект помещается и инкубируется на имплантате, затем непрореагировавшие клетки удаляют, материал фиксируют, окрашивают и микроскопируют. На готовых препаратах оценивают число и состояние адгезирующих элементов. В другом, непрямом методе тестируемый материал измельчают, заполняют, например, в колонку и пропускают с определенной скоростью клетки. Элеат собирают и подсчитывают в нем количество прошедших клеточных форм. Второй способ требует большего количества расходного материала. Можно объединить обе технологии с изучением клеток в протекающей жидкости и на поверхности микрогранул тестируемого биоматериала (Иманаси, 1987; Гольдберг и др., 1992).

При интерпретации полученных данных следует учитывать, что сама по себе адгезия является лишь первым шагов во взаимодействии клеток с имплантатом. Будет ли этот контакт прочным, как пойдет дальше развитие событий, может показать только метод культуры ткани в системах in vitro и in vivo. Тем не менее, данная технология позволяет осуществить первоначальный скрининг принципиальной возможности использования материалов в качестве имплантатов.

Однако для окончательного решения вопроса об использовании данного материала в качестве имплантата требуется проведение углубленных доклинических испытаний.


А.В. Карпов, В.П. Шахов
Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики